[發明專利]肺炎支原體耐藥診斷試劑盒

有效

• 申請號: 201410073883.9
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103820557B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 李靜宜;辛德莉;孫嵐;郭東星;姜越
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京友誼醫院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京汲智翼成知識產權代理事務所(普通合伙)11381
• 代理人: 陳曦,賈興昌

技術領域

本發明涉及一種PCR檢測試劑盒，更具體地說，涉及一種實時定量的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。

背景技術

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，簡稱為MP）是兒童、青少年及成人上、下呼吸道感染的常見病原體。23%～50%的學齡前兒童和青少年社區獲得性肺炎是由MP感染導致的，流行周期為3～7年。肺炎支原體肺炎易復發或遷延不愈，重癥患者常合并肺外癥狀，對健康危害嚴重。

MP無細胞壁結構，臨床上只能選擇抑制或影響其蛋白質和核酸合成的藥物，如大環內酯類抗生素、四環素類抗生素、喹諾酮類抗生素等。但由于其他抗生素的不良反應，治療兒童MP感染首選大環內酯類抗生素。自2001年發現對大環內酯類抗生素耐藥的MP以來，MP耐藥率逐年升高且流行范圍逐漸擴大，已有多個國家或地區分離到MP耐藥株。據文獻報道，日本2007年MP耐藥率已高達40%以上，韓國兒童住院患者MP耐藥率為61.3%，意大利為26%，法國為9.8%，德國為3%。中國MP耐藥形勢則更為嚴峻，MP臨床分離株中92%以上大環內酯類抗生素耐藥。MP的耐藥機制主要是核糖體大亞基23S rRNA的基因突變和核糖體蛋白L4、L22基因突變，其中23S rRNA結構域V區的2063位點和2064位點的點突變占主導地位。我國發現的耐藥MP中2063A-G突變占97%以上。

目前，臨床上常用的MP診斷方法為MP培養、血清學檢測和PCR。MP培養耗時長，陽性率低，耐藥性的監測通常需要體外培養并進行藥敏試驗，測定最小抑菌濃度（MIC）。血清學檢測方法簡便易行，但需要患者恢復期血清做對照，急性期診斷效果不佳。常規PCR方法具有快速、陽性率高的優點，但存在假陽性的問題。熒光定量PCR以特異性強、定量準確、重復性好等優點而得到迅速發展，但其并不能判斷病原體耐藥性，對臨床治療的指導意義有限。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。該試劑盒可以通過建立熒光定量PCR等位基因鑒別方法，對MP2063位點的基因型進行鑒定，在診斷的同時判斷其耐藥性。

為實現上述的發明目的，本發明采用下述的技術方案：

一種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒，包括：

上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；

下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；

探針序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC標記；

探針序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM標記。

本發明提供的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒通過建立熒光定量PCR等位基因鑒別方法，對MP2063位點的基因型進行鑒定，在快速診斷的同時判斷其耐藥性，從而指導臨床實踐。該診斷試劑盒的檢測靈敏度較好，臨床應用前景巨大。

附圖說明

圖1為MP標準株FH、耐藥株307及構建的標準質粒PCR結果。其中，1為MP標準株FH，2為耐藥株307，3為敏感2063A質粒，4為耐藥2063G質粒，N為陰性對照，P為陽性對照；M為100bp DNA Ladder。

圖2為實時熒光定量PCR標準曲線。

圖3顯示了實時熒光定量PCR鑒定2063等位基因的診斷價值。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。

肺炎支原體（MP）是引起兒童肺炎和肺外并發癥的一種常見病原體。目前兒童MP感染的主要治療藥物為大環內酯類抗生素。近年來國內、國際臨床上越來越多分離到耐大環內酯類抗生素的MP株，主要耐藥機制是核糖體大亞基的23S rRNA的編碼基因突變。在我國，目前報道97%以上的耐藥株為2063A→G突變。自2000年第一次報道實時定量PCR診斷MP以來，已有大量的針對不同擴增序列的實時定量PCR診斷方法研究出現，也出現很多市售試劑盒。但這些方法只能給出陽性或陰性結果，不能獲得耐藥信息。因此，本發明針對導致MP耐藥2063位A→G的點突變，設計引物和探針，建立MP耐藥診斷一步法的試劑盒。下面對此展開詳細具體的說明。

1材料與方法

1.1標本

1.1.1MP標準株