[發(fā)明專利]一種高溫熱穩(wěn)定酸性α-半乳糖苷酶Gal27A及其基因和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410073303.6
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103820420A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 姚斌;石鵬君;王慧敏;羅會穎;黃火清;馬銳;王亞茹;楊培龍;柏映國;孟昆
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/40
• 分類號: C12N9/40;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23K1/165;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/78
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域。具體地，本發(fā)明涉及一種高溫熱穩(wěn)定酸性α-半乳糖苷酶Gal27A及其基因和應用。

背景技術

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside?galactohydrolase;EC3.2.1.22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶。催化移除不同底物中α-連接的末端非還原性D-半乳糖。它不僅能夠水解含α-半乳糖苷鍵的寡糖，例如蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等，而且還能夠催化含該鍵的多糖，如α-半乳甘露聚糖等。

近年來，隨著α-半乳糖苷酶生理功能的發(fā)現，綠色飼料的興起以及人們環(huán)保意識的增強，能源的再生利用研究，人們對α-半乳糖苷酶的研究和利用已進入了一個新的階段。α-半乳糖苷酶已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料及生物技術等諸多領域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應用價值。

α-半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植物、微生物中。在各種哺乳動物組織的勻漿中也存在α-半乳糖苷酶，豬腎的半乳糖苷酶是與顆粒部分相連接。人和鼠的甲狀腺、腎臟和脾臟的酶活性最高。植物來源(如咖啡、黃瓜、蠶豆、西瓜)的α-半乳糖苷酶研究的比較詳細。一般來說，真菌和酵母來源的α-半乳糖苷酶其作用最適pH在3.0-6.0之間，而細菌來源的α-半乳糖苷酶則比真菌有更高的最適pH(5.0-7.5)。植物來源的α-半乳糖苷酶根據其作用pH的不同分為酸性α-半乳糖苷酶和堿性α-半乳糖苷酶。目前國內外，雖然許多α-半乳糖苷酶被克隆分離及性質測定，但這些酶的性質特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達量低等，均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到一種新的能夠滿足實際應用需求的α-半乳糖苷酶，從而能夠進一步推廣該α-半乳糖苷酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用。

本發(fā)明從Talaromyces?leycettanus?JCM12802菌株中得到了一個新的α-半乳糖苷酶基因。其編碼的α-半乳糖苷酶具有以下幾個優(yōu)點：酸性、高溫、熱穩(wěn)定、較高比活、容易發(fā)酵生產，并且與甘露聚糖酶具有良好的協同效應。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的α-半乳糖苷酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會更有應用價值比以前所報道的α-半乳糖苷酶。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種酸性、高溫、良好的熱穩(wěn)定性、較高比活的α-半乳糖苷酶。

本發(fā)明的再一目的是提供上述α-半乳糖苷酶的基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述α-半乳糖苷酶的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述α-半乳糖苷酶基因的重組菌株。

本發(fā)明的再一目的是提供一種制備α-半乳糖苷酶的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述α-半乳糖苷酶的應用。

本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用的新的高溫α-半乳糖苷酶。該α-半乳糖苷酶Gal27A，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1：

其中，該酶全長486個氨基酸，N端21個氨基酸為信號肽序列“MDKAVAALLLSVGLHSLGAAA”。

因此，成熟的α-半乳糖苷酶Gal27A的理論分子量為53kDa，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2：

該α-半乳糖苷酶Gal27A同時具有酸性、高溫、熱穩(wěn)定、較高比活等特點。最適pH為4.0，在pH3-pH5.5范圍內，該酶能夠維持其60%以上的酶活力；最適溫度70℃，在65℃時依然具有60%以上的酶活力，該酶屬于高溫酶，在60℃下處理60min，剩余酶活在95%以上，具有很好的穩(wěn)定性；同時高密度發(fā)酵酶活性高，易于工業(yè)化生產。

本發(fā)明還提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的基因。該酶的全基因序列如SEQ?ID?NO.3所示：

本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這α-半乳糖苷酶基因gal27A，DNA全序列分析結果表明，α-半乳糖苷酶gal27A結構基因全長1711bp，含有3個內含子，+103～192bp，+517～611bp，+982～1049bp，為其內含子序列，cDNA長1458bp，其cDNA序列如SEQ?ID?NO.4所示：

其中，信號肽的堿基序列為：