[發明專利]克隆表達優化的非洲豬瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構建方法

在審

• 申請號: 201410073118.7
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103952401A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 張彩虹;呂建強;楊俊興;曹琛福;宗卉;陶虹;孫潔;曾少靈;葉奕優;黃超華;劉建利;花群義
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/40;C12N15/79;A61K48/00;A61K39/00;A61P31/14
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司 44217
• 代理人: 陸軍

1.一種克隆表達優化的非洲豬瘟VP72基因引物序列，其特征在于，該引物序列如序列表中的SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所述，其中SEQ?ID?No.1為非洲豬瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ?ID?No.2為非洲豬瘟病毒VP72基因下游引物。

2.一種克隆表達優化的非洲豬瘟VP72基因，其特征在于，包括序列表中SEQ?ID?NO.3的基因序列。

3.一種非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，該疫苗由序列表中SEQ?ID?NO.3的非洲豬瘟VP72基因和真核表達載體組成。

4.根據權利要求3所述的非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表達載體可為任何一種DNA疫苗載體。

5.根據權利要求4所述的非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表達載體為pcDNA3.3。

6.一種非洲豬瘟核酸疫苗的構建方法，包括如下步驟：

（1）合成ASFV?VP72基因，并克隆至pUC18克隆載體中，標記為pUC18-ASFV?VP72；

（2）根據已經合成的ASFV?VP72基因核酸序列，利用核酸引物設計軟件設計特異性PCR引物，并在上游引物引入G/A?NN序列，引物序列分別如序列表中SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示；并從pUC18-ASFV?VP72質粒中擴增獲得包括NN序列和ASFV?VP72全基因的序列，大小為1944bp，如序列表中SEQ?ID?NO.3所示；

（3）將步驟（1）中擴增獲得的ASFV?VP72基因經過凝膠電泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表達載體中，得到重組質粒pcDNA-ASFV-VP72；

（4）用Puv?I限制性內切酶將高度純化的pcDNA-ASFV-VP72線性化后，利用脂質體將其轉染到BHK-21細胞中，經過G418持續加壓篩選、PCR檢測鑒定后，獲得陽性細胞系。