[發明專利]一種5′端tRNA半分子檢測方法

有效

• 申請號: 201410072557.6
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103789447B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 鄭曉飛;付漢江;劉荻
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種5′端tRNA半分子檢測方法，該檢測方法的特征在于其是基于分離純化的細胞和組織總RNA，經多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端進行Poly(A)加尾，再與DNA探針雜交，后經RNase?H消化與DNA探針互補的RNA序列，再由oligo(dT)_12-30-錨定引物進行反轉錄獲得cDNA，以5′端tRNA半分子和錨定引物的序列為PCR反應的上下游引物，擴增檢測5′端tRNA半分子。

2.權利要求1中所述方法包括五個主要步驟：(1)tRNA半分子的poly(A)加尾；(2)DNA探針與tRNA分子雜交；(3)RNase?H消化與DNA探針雜交的tRNA序列；(4)反轉錄反應；(5)PCR擴增反應。

3.權利要求1中所述的DNA探針的特征在于長度為13-30個堿基的與待檢測的tRNA分子的3′端序列互補的寡聚DNA分子，其3′端的羥基被修飾，修飾基團可以是磷酸基團或甲氧基等。

4.權利要求1中所述的反轉錄反應所用引物的特征在于反轉錄oligo(dT)_12-30-錨定引物長度為40-60nt，5′端為20-30nt的錨定序列，3′端為12-30nt的dT，在3′末端加上兩個堿基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后兩個堿基起錨定作用。

5.權利要求1中所述的PCR擴增引物特征在于上游引物是待檢測5′端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是與反轉錄引物的錨定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。

6.權利要求1中所述的5′端tRNA半分子檢測反應中所使用的PCR擴增引物可以進行包括熒光分子、生物素和地高辛等分子的修飾。

7.權利要求1中所述的PCR反應體系中可以加入熒光染料或分子信標進行實時定量PCR反應。

8.權利要求1-7中所述的檢測方法在5′端tRNA半分子檢測分析中的應用。