[發明專利]可檢測感染弓形蟲的標識性mmu-miR-511-5p

有效

• 申請號: 201410072204.6
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103865928A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 姜寧;陳啟軍;賈博寅
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說是可檢測感染弓形蟲的標識性mmu-miR-511-5p。?

背景技術

剛地弓形蟲是一種專性細胞內寄生蟲。人類首例報告為1908年，與動物弓形蟲病同時發現，全世界約有5～10億人感染弓形蟲病，人類與這種疾病的斗爭已進行了一個多世紀，但至今疾病仍在全球肆虐。我國每年約有8～9萬名由于弓形蟲引起損害的新生兒出生，感染弓形蟲的婦女其異常生產率是正常孕婦的3倍，造成畸胎，死胎。WHO和美國CDC已將弓形蟲病作為艾滋病的指征性疾病。?

目前認為，從動物和人體所分離出的弓形蟲均屬于同一個種，由于實際中弓形蟲不同分離株的毒力存在差異，一般根據弓形蟲感染小鼠后的毒性可將其分為鼠毒力株和鼠無／低毒力株，或根據基因連鎖圖譜分為三個型(Type?I、Type?II、TypeIII)。Type?I為強毒株，代表蟲株RH株為國際標準強毒株，TypeII，TypeIII為弱毒株，基因型變異要大得多。人類感染的弓形蟲蟲株大多數屬于Type?II基因型，比較常見的有ME49株等。因此，目前對于弓形蟲的檢測和防治主要針對I型RH株和II型ME49株。?

弓形蟲病的早期診斷仍是亟待解決的重要問題，該病診斷方法大致可分為病原學檢查、免疫學方法、分子生物學技術等3類。傳統的病原學檢查方法如鏡檢、蟲體分離法等費時、費力，且特異性和敏感性不高，不能適應當前弓形蟲病診斷及防治的需要。免疫學診斷方法，即檢測弓形蟲抗體，但弓形蟲病患者常伴有免疫功能低下，往往會出現抗體水平的下降，難以做出正確的診斷。分子生物學診斷方法簡便快捷，靈敏性好，特異性高，包括普通PCR、巢式PCR、熒光定量PCR、原位PCR等，所應用的診斷基因標靶包括B1、ITS-1、P30基因等，但由于這些診斷基因在弓形蟲基因組中的拷貝數并不高(1-30拷貝)，影響該病的診斷。因此，選擇高特異性及敏感性的臨床生物標志物，并建立快速、準確的實驗方法，對于弓形蟲的檢測、診斷和疾病的治療具有重要的臨床價值。?

近年來，發現microRNAs(miRNAs)與各種疾病的發生和發展有著極為密切的關系。miRNAs表達具有較高的組織特異性、在血液中具有較高穩定性，推測miRNAs可能是一個理想的生物檢測標志物，并已經應用于急性心肌損傷，糖尿病，肝癌，肺癌等臨床研究。疾病的早期診斷，也成為miRNAs研究的熱點。因其具有取材方便、創傷小、可連續體?外檢測及擇時檢測的優點，并且血漿中miRNAs的高度穩定性對于疾病的臨床診斷具有可靠性強，準確率高的特點。因此，篩選弓形蟲感染的特異性miRNA作為檢測標志物，建立基于該標志物的檢測方法意義重大。?

發明內容

本發明的目的是提供可檢測感染弓形蟲的標識性mmu-miR-511-5p。?

可檢測感染弓形蟲的標識性mmu-miR-511-5p，它的堿基序列為augccuuuugcucugcacuca。?

檢測感染弓形蟲的Q-PCR試劑盒，包括針對堿基序列為augccuuuugcucugcacuca的mmu-miR-511-5p，所設計的引物；?

所述的引物包括堿基序列atgccttttgctctgcactca；?

所述的弓形蟲為弓形蟲RH株或ME49株。?

本發明提供了可檢測感染弓形蟲的標識性mmu-miR-511-5p，在弓形蟲感染的小鼠模型中，通過提取血漿總RNA，反轉錄獲得其cDNA，采用Q-PCR技術篩選了高表達的mmu-miR-511-5p，與弓形蟲感染具有明顯的相關性，可作為弓形蟲病診斷的標識性miRNA。并以其作為標志物建立了弓形蟲感染的Q-PCR檢測方法，具有較高的敏感性和特異性，為弓形蟲病的臨床診斷提供一種可靠的檢測依據和快速檢測方法，具有重要的臨床應用價值。?

附圖說明

圖1.感染RH株和ME49株小鼠血漿中mmu-miR-511-5p的差異表達情況；?

圖2.感染RH株和ME49株小鼠血漿中mmu-miR-511-5p的定量分析；?

圖3.ROC曲線分析血漿mmu-miR-511-5p對不同蟲株引起弓形蟲病的鑒別效能；?

圖4.血漿mmu-miR-511-5p及cel-miR-39的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析。?

具體實施方式

實施例1BALB／c攻蟲實驗?