[發(fā)明專(zhuān)利]可檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的標(biāo)識(shí)性mmu-miR-712-3p

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410072189.5
• 申請(qǐng)日: 2014-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103866011A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳啟軍;姜寧;賈博寅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/113
• 代理公司: 長(zhǎng)春市東師專(zhuān)利事務(wù)所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是可檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的標(biāo)識(shí)性mmu-miR-712-3p。?

背景技術(shù)

剛地弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)。人類(lèi)首例報(bào)告為1908年，與動(dòng)物弓形蟲(chóng)病同時(shí)發(fā)現(xiàn)，全世界約有5～10億人感染弓形蟲(chóng)病，人類(lèi)與這種疾病的斗爭(zhēng)已進(jìn)行了一個(gè)多世紀(jì)，但至今疾病仍在全球肆虐。我國(guó)每年約有8～9萬(wàn)名由于弓形蟲(chóng)引起損害的新生兒出生，感染弓形蟲(chóng)的婦女其異常生產(chǎn)率是正常孕婦的3倍，造成畸胎，死胎。WHO和美國(guó)CDC已將弓形蟲(chóng)病作為艾滋病的指征性疾病。?

目前認(rèn)為，從動(dòng)物和人體所分離出的弓形蟲(chóng)均屬于同一個(gè)種，由于實(shí)際中弓形蟲(chóng)不同分離株的毒力存在差異，一股根據(jù)弓形蟲(chóng)感染小鼠后的毒性可將其分為鼠毒力株和鼠無(wú)/低毒力株，或根據(jù)基因連鎖圖譜分為三個(gè)型(Type?I、Type?II、TypeIII)。Type?I為強(qiáng)毒株，代表蟲(chóng)株RH株為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，TypeII，TypeIII為弱毒株，基因型變異要大得多。人類(lèi)感染的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株大多數(shù)屬于Type?II基因型，比較常見(jiàn)的有ME49株等。因此，目前對(duì)于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)和防治主要針對(duì)I型RH株和II型ME49株。?

弓形蟲(chóng)病的早期診斷仍是亟待解決的重要問(wèn)題，該病診斷方法大致可分為病原學(xué)檢查、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)等3類(lèi)。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查方法如鏡檢、蟲(chóng)體分離法等費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且特異性和敏感性不高，不能適應(yīng)當(dāng)前弓形蟲(chóng)病診斷及防治的需要。免疫學(xué)診斷方法，即檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體，但弓形蟲(chóng)病患者常伴有免疫功能低下，往往會(huì)出現(xiàn)抗體水平的下降，難以做出正確的診斷。分子生物學(xué)診斷方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏性好，特異性高，包括普通PCR、巢式PCR、熒光定量PCR、原位PCR等，所應(yīng)用的診斷基因標(biāo)靶包括B1、ITS-1、P30基因等，但由于這些診斷基因在弓形蟲(chóng)基因組中的拷貝數(shù)并不高(1-30拷貝)，影響該病的診斷。因此，選擇高特異性及敏感性的臨床生物標(biāo)志物，并建立快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)、診斷和疾病的治療具有重要的臨床價(jià)值。?

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)microRNAs(miRNAs)與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著極為密切的關(guān)系。miRNAs表達(dá)具有較高的組織特異性、在血液中具有較高穩(wěn)定性，推測(cè)miRNAs可能是一個(gè)理想的生物檢測(cè)標(biāo)志物，并已經(jīng)應(yīng)用于急性心肌損傷，糖尿病，肝癌，肺癌等臨床研究。疾病的早期診斷，也成為miRNAs研究的熱點(diǎn)。因其具有取材方便、創(chuàng)傷小、可連續(xù)體?外檢測(cè)及擇時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，并且血漿中miRNAs的高度穩(wěn)定性對(duì)于疾病的臨床診斷具有可靠性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。因此，篩選弓形蟲(chóng)感染的特異性miRNA作為檢測(cè)標(biāo)志物，建立基于該標(biāo)志物的檢測(cè)方法意義重大。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供可檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的標(biāo)識(shí)性mmu-miR-712-3p。?

可檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的標(biāo)識(shí)性mmu-miR-712-3p，它的堿基序列為ugcgagucacccccggguguug。?

檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的Q-PCR試劑盒，包括針對(duì)堿基序列為ugcgagucacccccggguguug的mmu-miR-712-3p，所設(shè)計(jì)的引物；?

所述的引物包括堿基序列tgcgagtcacccccgggtgttg；?

所述的弓形蟲(chóng)為弓形蟲(chóng)RH株或ME49株。?

本發(fā)明提供了可檢測(cè)感染弓形蟲(chóng)的標(biāo)識(shí)性mmu-miR-712-3p，在弓形蟲(chóng)感染的小鼠模型中，通過(guò)提取血漿總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，采用Q-PCR技術(shù)篩選了高表達(dá)的mmu-miR-712-3p，與弓形蟲(chóng)感染具有明顯的相關(guān)性，可作為弓形蟲(chóng)病診斷的標(biāo)識(shí)性miRNA。并以其作為標(biāo)志物建立了弓形蟲(chóng)感染的Q-PCR檢測(cè)方法，具有較高的敏感性和特異性，為弓形蟲(chóng)病的臨床診斷提供一種可靠的檢測(cè)依據(jù)和快速檢測(cè)方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。?

附圖說(shuō)明

圖1.感染RH株和ME49株小鼠血漿中mmu-miR-712-3p的差異表達(dá)情況；?

圖2.感染RH株和ME49株小鼠血漿中mmu-miR-712-3p的定量分析；?

圖3.ROC曲線(xiàn)分析血漿mmu-miR-712-3p對(duì)不同蟲(chóng)株引起弓形蟲(chóng)病的鑒別效能；?

圖4.血漿mmu-miR-712-3p及cel-miR-39的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1BALB/c攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)?