[發明專利]一種凝血塊中提取白細胞的方法

有效

• 申請號: 201410070727.7
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103820388A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 樊衛平;覃艷紅;李靜
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發明涉及一種凝血塊中提取白細胞的方法。

背景技術

科學實驗和臨床檢驗中常常遇到對同一個血液標本既需要血清，也需要白細胞進行相關實驗或檢測的情況。而目前從凝固血液分離得到血清后，凝血塊中禁錮的白細胞便不能再繼續利用，為此當既需要血清又需要白細胞時，臨床和科研往往都需要加大血液采集量，將所得血液分成兩份，一份凝固血液用于分離血清，另一份抗凝血用于提取白細胞、核酸或者細胞蛋白。

動物相關免疫學科研中，免疫動物血液的獲得量常常不能滿足科研需要，尤其是在周期性采集小鼠、大鼠等實驗動物的血液檢測免疫狀態時，常常采集不到足夠多的血液，以便部分凝固后提取血清，檢測抗體效價、細胞因子的含量，另一部分抗凝后分離白細胞，進行中性粒細胞、T細胞、B細胞以及NK細胞等的相關免疫功能檢測。

臨床檢驗也面臨血液凝固、血塊收縮獲得血清后，不能再對此血樣本進行白細胞相關檢測的問題。比如檢測乙肝五項和肝功能等需要血清，而這份血中的白細胞禁錮在凝血塊纖維網絡中不能再進行流式細胞術檢測其免疫細胞亞群及功能狀態，甚至細胞核酸的提取也常常需要多采集一份患者的血液。而新生兒患者和嬰幼兒患者血管纖細，加之發熱、腹瀉等疾病狀態使機體脫水，血管充盈不足，加劇了血液采集的困難，即使是多采集1ml血液，在這些患兒都較為困難。

如果能將采集完血清的凝血塊中的白細胞釋放出來，并保持其功能和活性，則采集很少量的一份血液就可以既滿足對血清檢測的需要也滿足對白細胞檢測的需要，這樣不僅可以提高科研成功的機會，也可以減少患者的痛苦，寬慰患兒的父母和家人，同時也減輕了采血人員的工作負擔。

發明內容

?本發明的目的是解決現存的無法從凝血塊中提取白細胞的技術問題，提供一種凝血塊中提取白細胞的方法。

為了解決上述問題，本發明采取的技術方案是：

一種凝血塊中提取白細胞的方法，其包括下列步驟：?

1）將100目過濾網覆蓋在燒杯或平皿口上；

2）剝離并轉移凝血塊于過濾網上；

3）用玻璃注射器內芯研磨凝血塊，同時不斷滴加生理鹽水濕潤并沖洗凝血塊以及接觸凝血塊的玻璃注射器內芯，使血細胞穿過過濾網匯集于燒杯或平皿內，不需要的凝血纖維留在過濾網上；

4）轉移血細胞于離心管中，1000rpm?離心8min，棄上清，收集血細胞；

5）加入溶血素裂解收集的血細胞中的紅細胞得到白細胞；或者將所收集到的血細胞用生理鹽水稀釋至原血液體積的2倍，再用常規淋巴細胞分層液分離獲取外周血單個核細胞。

采用流式細胞術檢測本發明從凝血塊提取白細胞的數量以及CD4⁺和CD8⁺T細胞占淋巴細胞的百分比，并與同一供者的等量抗凝血所得白細胞的相應檢測結果進行比較，經配對t檢驗統計分析，結果發現白細胞數量無差別(P＞0.05)，CD4⁺及CD8⁺T細胞占淋巴細胞的百分比也無差別?(P＞0.05)，詳見表1和表2，表1是對5位健康供者血液的檢測結果比較，表2是對5只小鼠血液的檢測結果比較。說明本發明的方法既不影響白細胞的得量，也不破壞白細胞的細胞膜結構。

表1?人抗凝血與凝血塊提取白細胞數量以及CD4⁺和CD8⁺T細胞百分比比較表

注：*，與抗凝血組比較，P＞0.05

表2?小鼠抗凝血與凝血塊提取白細胞數量以及CD4⁺和CD8⁺T細胞百分比比較表

注：*，與抗凝血組比較，P＞0.05

無菌操作進行ConA刺激T細胞增殖試驗，檢測凝血不同時間點（4h/8h/12h/24h）本發明提取人外周血單個核細胞（PBMC）中T細胞的增殖活性，并與同一供者來源的等量抗凝血的T細胞增殖活性進行比較，經重復測量數據的方差分析法統計，發現血液凝固12h內本發明提取T細胞的增殖功能不下降(各組SI比較，P＞0.05)，詳見表3。而12h的時間界限足以對同一份血液完成血清和白細胞分離及隨后的各相關檢測或實驗。

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表3抗凝血與不同時間凝血塊提取PBMC中T細胞增殖結果（SI）比較