[發明專利]血清中抗原類蛋白的化學發光蛋白芯片方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410069738.3
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103823058A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李寧;張愛英;張永宏;王升啟
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京佑安醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N21/64;G01N21/76
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

技術領域

本發明涉及血清抗原檢測技術，特別涉及血清中抗原類蛋白的化學發光蛋白芯片方法和試劑盒。

背景技術

肝細胞癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國是乙肝大國，肝癌發病率占全球總數的55%，近80%患者確診時已屬中晚期。術后復發轉移率高，5年以上長期生存率僅為10%左右。肝癌的早期診斷成為提高患者長期生存率的最佳有效途徑。

在肝癌早期診斷研究領域，血清腫瘤分子標志物一直受到普遍關注。目前基礎研究已發現100多種標志物與肝癌相關，AFP仍是目前肝癌定性診斷的最佳標志物，對肝癌的確診、預后推測、療效判斷及復發轉移的監測具有良好的臨床價值。

目前用于血清腫瘤分子標志物的檢測方法包括：傳統的放射免疫分析（RIA）、酶聯免疫分析（ELISA）、化學發光免疫分析系統、熒光免疫分析系統及電化學發光免疫分析系統等。上述檢測方法存在著血量大、檢測時間長、費用高等問題。以ELISA為例，每次檢測需要患者血清50ul,花費3個多小時。

在癌癥類重大疾病的診斷過程中，提供快速、高效、準確的腫瘤標志物分析方法實現準確的早期診斷和及時的后續治療具有重大意義。

發明內容

本發明基于本領域在檢測血清中AFP抗原方面的技術需求及缺陷，提供了一種適合于定量定性檢測生物樣品中抗原類蛋白的方案，該方案不僅僅適合于檢測血清中的AFP抗原，對檢測抗原類蛋白物質具有通用性，具有省時、經濟、準確且微型化的優點。本發明的技術方案如下：

血清中的抗原類蛋白的化學發光蛋白質芯片檢測方法，其特征在于：

采用以下步驟：

（1）獲取標準曲線：

所述標準曲線以目標抗原類蛋白的標準品的梯度濃度為橫坐標，以梯度濃度的標準品經化學發光檢測方法檢測到的對應化學發光像素值為縱坐標；

（2）樣品檢測：

采用與上述化學發光檢測方法相同的程序檢測待測血清樣品中的目標抗原類蛋白的熒光像素值，帶入標準曲線的回歸方程式中計算出相應的目標抗原類蛋白濃度，乘以血清樣品的稀釋倍數得出實際的濃度；

并且所述化學發光檢測方法采用蛋白質芯片，所述蛋白質芯片至少包括一個檢測亞區，一個所述檢測亞區檢測一份血清樣品；

所檢測亞區內按斑點狀設置有檢測斑和對照斑，所述檢測斑上固定有所述目標抗原類蛋白的特異性抗體，所述對照斑上固定有牛血清白蛋白作為陰性對照；

一個所述檢測亞區內的所述檢測斑至少為兩個，且固定的特異性抗體濃度相同。

所述化學發光檢測方法的步驟如下：

待測血清樣本滴加在所述蛋白芯片的檢測亞區上，孵育后形成抗原特異性抗體復合物；用PBST洗滌檢測亞區，去除非特異結合物；

加入用PBS稀釋的生物素標記的一抗,形成特異性抗體-抗原-一抗復合物；用PBST洗滌4次，去除非特異結合物；

加入用PBS稀釋的HRP標記的鏈酶親和素，形成特異性抗體-抗原-一抗-HRP標記的鏈酶親和素復合物，用PBST洗滌未結合的鏈酶親和素；

加入HRP底物發光液，化學成像儀進行掃描得到熒光像素值；

其中所述特異性抗體與所述一抗物種來源不同。

所述檢測亞區內包括四個檢測斑，四個對照斑；檢測斑和對照斑各排成一列。

所述蛋白質芯片具有十個所述檢測亞區。

所述樣品檢測步驟中，同時以正常血清、目標抗原類蛋白的標準品為對照檢驗所述標準曲線及所述蛋白質芯片的穩定性和有效性。

一種用于分析血清中抗原類蛋白的試劑盒，其特征在于：包括蛋白質芯片；所述蛋白質芯片至少包括一個檢測亞區，一個所述檢測亞區檢測一份血清樣品；

所檢測亞區內按斑點狀設置有檢測斑和對照斑，所述檢測斑上固定有所述目標抗原類蛋白的特異性抗體，所述對照斑上固定有牛血清白蛋白作為陰性對照；

一個所述檢測亞區內的所述檢測斑至少為兩個，且固定的特異性抗體濃度相同。

所述檢測亞區內包括四個檢測斑，四個對照斑；檢測斑和對照斑各排成一列。

所述蛋白質芯片具有十個所述檢測亞區。

所述蛋白質芯片具有多個所述檢測亞區，所述檢測亞區之間的分界采用凸起作為物理隔斷。避免樣品之間的相互污染。

所述的試劑盒還包括目標抗原類蛋白的標準品，和/或以所述目標抗原類蛋白的標準品制作的標準曲線或直線回歸方程說明書。