[發(fā)明專利]攜帶p21ras單鏈抗體基因腫瘤特異性腺病毒載體的構(gòu)建及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410069543.9
• 申請(qǐng)日: 2014-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN103882057A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊舉倫;李靜;姜英翰;劉秀娟;馮強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;A61K48/00;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，涉及基因工程和腫瘤生物治療領(lǐng)域。具體的涉及利用分子克隆技術(shù)，用腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控病毒E1A、E1B蛋白的表達(dá)，改造腫瘤特異性腺病毒的纖毛蛋白使腺病毒外殼具有5型／35型腺病毒嵌合型纖毛蛋白，同時(shí)在腫瘤特異性腺病毒基因中插入p21ras單鏈抗體基因，通過CIK細(xì)胞將攜帶該基因的雙靶向腫瘤特異性腺病毒運(yùn)載到腫瘤組織部位，協(xié)同發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

背景技術(shù)

目前，腫瘤已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤死亡率高、生存期短，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人們的身體健康。統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界每年約有700多萬(wàn)人死于腫瘤，且有逐年上升趨勢(shì)。據(jù)2005年新英格蘭雜志報(bào)道癌癥已成為中國(guó)男性第一位、女性第三位的死亡原因。因此，預(yù)防和治療惡性腫瘤已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

腫瘤傳統(tǒng)治療是以手術(shù)、化療和放療等方法為主，而這些常規(guī)的治療手段無(wú)法徹底清除殘存的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致其治愈率低，復(fù)發(fā)率和病死率高，無(wú)法明顯改善人們對(duì)腫瘤相對(duì)無(wú)奈的局面。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程的發(fā)展，腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制得到進(jìn)一步闡明，腫瘤基因治療技術(shù)也隨之發(fā)展，為腫瘤治療提供了一種新的且有希望的治療手段。

ras基因是一種重要的細(xì)胞原癌基因，其命名來(lái)自大鼠肉瘤的英文rat?asrcoma。ras基因家族包括三個(gè)主要成員，即H-ras、K-ras、N-ras，分別定位于第12、11和1號(hào)染色體，編碼由188-189個(gè)氨基酸組成的分子量約為21KD的蛋白質(zhì)，即p21ras蛋白，三種p21ras蛋白的氨基酸序列約有85％的同源性。

p21ras蛋白作為極其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常分化和增殖。p21ras蛋白合成后，其羧基端必須經(jīng)過復(fù)雜的翻譯后修飾，使其準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。p21ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分別與GTP和GDP結(jié)合，p21ras蛋白中GTP結(jié)合與在GTP酶激活蛋白作用下水解為GDP之間的循環(huán)形成了一種分子開關(guān)機(jī)制，即通過鳥嘌呤核苷酸不同形式的結(jié)合形成不同的激酶構(gòu)象，也即ras蛋白的活性和非活性形式。p21ras蛋白在細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)刺激下與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)的p21ras-GTP形式，從而激活p21ras蛋白下游眾多信號(hào)通道，促進(jìn)細(xì)胞分裂、增生，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞間接觸抑制減弱。

當(dāng)ras基因發(fā)生突變或p21ras蛋白過表達(dá)或GTP酶激活蛋白缺失或生長(zhǎng)因子受體活化及ras下游效應(yīng)子的突變或擴(kuò)增，均可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。研究表明，大約30％的人類腫瘤中存在ras基因突變或ras基因過表達(dá)，部分學(xué)者認(rèn)為p21ras蛋白主要在腫瘤形成的早期階段充當(dāng)重要作用。

用于腫瘤生物治療的完整抗體由于分子量較大，其血管通透性弱，擴(kuò)散入腫瘤內(nèi)能力差，半衰期長(zhǎng)，毒性高而限制了其靶向傳遞及腫瘤拮抗應(yīng)用效果。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的單鏈抗體(single?chain?fragment?vriable，ScFv)是用柔性寡核苷酸片段連接完整抗體的可變區(qū)構(gòu)建的線性片段，分子量只有完整抗體的1／6；滲透力強(qiáng)；在非靶向組織中滯留時(shí)間短、易從體內(nèi)清除；且免疫原性低，用于人體幾乎不會(huì)產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)；容易在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得，易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，實(shí)用性強(qiáng)。將ScFv基因用病毒載體等導(dǎo)入非淋巴細(xì)胞內(nèi)，通過偶聯(lián)定位信號(hào)序列，定向表達(dá)于亞細(xì)胞器(如細(xì)胞核、細(xì)胞漿或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))而構(gòu)建的抗體稱為細(xì)胞內(nèi)抗體。這種抗體通過在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合某種特定蛋白使其失活，并且封閉該蛋白與其它蛋白相互作用，或干擾該蛋白的正常胞內(nèi)定位，從而阻止其發(fā)揮正常生物學(xué)功能而起作用。細(xì)胞內(nèi)抗體用于腫瘤基因治療是通過將抗癌相關(guān)蛋白的抗體基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的ScFv與癌相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

腫瘤靶向性溶瘤病毒，又稱條件復(fù)制型病毒(conditionally?replicating?adenoviruscs，CRAd)，是一種通過基因工程技術(shù)改造病毒基因組，使其能夠攜帶抑癌基因并選擇性地在腫瘤細(xì)胞中完成感染、復(fù)制周期，從而特異性溶解、殺傷腫瘤細(xì)胞，而在正常體細(xì)胞內(nèi)這種能力減弱甚至消失。改造后的病毒載體可選擇性地殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞，該載體具有一定程度的靶向性。溶瘤病毒作為一種特殊的腫瘤治療藥物和基因治療載體近兩年來(lái)發(fā)展迅速，許多高效、靶向性病毒相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。