[發明專利]單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及測定方法

無效

• 申請號: 201410067910.1
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103834733A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 葉輝銘;蘇曉崧;張忠英
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院;葉輝銘
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒，其特征在于包括：

（1）全血基因組DNA提取試劑：所述全血基因組DNA提取試劑來源于商品化的血液基因組提取試劑盒，主要成分有緩沖液GD、緩沖液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脫緩沖液TB；

（2）多重PCR擴增引物：所述多重PCR擴增引物包括：

PCR引物1（Seq?NO1）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）上游引物5’-CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3’；

PCR引物2（Seq?NO2）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）下游引物5’-CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3’；

PCR引物3（Seq?NO3）：

MTHFR?C677T（rs1801133）上游引物5’-GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’；

PCR引物4（Seq?NO4）：

MTHFR?C677T（rs1801133）下游引物5’-CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3’；

其中引物1和引物3的5’端均進行生物素標記；

（3）多重PCR擴增反應試劑：所述多重PCR擴增反應試劑名為“2X?PyroMark?PCR?Master?Mix”，具體成分包括熱啟動TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鎂離子Mg²⁺、鈉離子Na⁺以及擴增反應特異性增強劑Q-Solution；

（4）單鏈DNA分離和純化試劑：所述單鏈DNA分離和純化試劑，包括鏈霉親和素瓊脂糖、PyroMark結合緩沖液、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液10X濃縮液；

（5）焦磷酸測序引物：所述焦磷酸測序引物包括：

測序引物1（Seq?NO5）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）測序引物5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’；

測序引物2（Seq?NO6）：

MTHFR?C677T（rs1801133）測序引物5’-TGCGTGATGATGAAAT-3’；

（6）焦磷酸測序試劑：所述焦磷酸測序試劑為DNA焦磷酸測序的常規試劑，包括PyroMark退火緩沖液、酶復合物、底物復合物和脫氧核糖核苷三磷酸復合物dNTP，其中dATP為人工修飾的α-硫代脫氧腺苷三磷酸，其余脫氧胞苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸未修飾；所述酶復合物包括焦磷酸測序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶；所述底物復合物為腺苷-5’-磷酸硫酸酐；

（7）盒體：全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設在盒體內。

2.單管聯合測定乙醛脫氫酶2與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的方法，其特征在于采用如權利要求1所述單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒，包括如下步驟：

（1）人類全血基因組DNA提取：采用所述單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的全血基因組DNA提取部分試劑，包括利用緩沖液GB和蛋白酶K溶解外周血白細胞，緩沖液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脫液TB洗脫得到DNA成分，整個提取反應以吸附柱CB3為DNA與細胞碎片和DNA與蛋白質分離的介質；

（2）多重PCR擴增反應：采用所述單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的多重PCR引物和多重PCR擴增反應試劑，具體的反應體系和反應條件如表1和表2所示；

表1多重PCR擴增反應體系

表2多重PCR擴增反應條件

（3）單鏈DNA樣本分離和純化：采用所述單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的單鏈DNA分離和純化試劑，包括在PyroMark結合緩沖液條件下高性能鏈霉親和素瓊脂糖與帶生物素的PCR產物的結合，而分離出單鏈DNA產物，然后分別經過70%乙醇、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液得到純化的單鏈DNA樣本；

（4）焦磷酸測序與結果分析：采用所述單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的焦磷酸測序引物和焦磷酸測序試劑，具體操作為分別在25μL用PyroMark退火緩沖液稀釋至0.3μmol/L的測序引物1和測序引物2中放入已純化的單鏈DNA產物，經過80℃持續加熱2min后，15～25℃下冷卻至少5min，同時在PyroMark?Q24試劑倉中加入系統計算所得的酶復合物、底物復合物和四種脫氧核糖核苷三磷酸的各自體積量，然后在PyroMark?Q24儀器上運行測序程序，最后測序結束后在PyroMark?Q24分析軟件運行AQ模式進行結果分析。