[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)小鼠膽固醇代謝基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR芯片

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410067737.5
• 申請(qǐng)日: 2014-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN103820552A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱長(zhǎng)保;肖君華;李凱;周宇荀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于檢測(cè)膽固醇基因的表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)小鼠膽固醇代謝基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR芯片（qPCR?array）。

背景技術(shù)

目前，研究基因表達(dá)差異的技術(shù)主要有表達(dá)譜芯片，RNA測(cè)序以及qPCR?array等。表達(dá)譜芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探針，固化在芯片上；將待測(cè)樣品（處理組）與對(duì)照樣品的mRNA以兩種不同的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，然后同時(shí)與芯片進(jìn)行雜交，通過(guò)分析兩種樣品與探針雜交的熒光強(qiáng)度的比值，來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化。RNA測(cè)序，也稱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組是指某個(gè)物種的特定組織或細(xì)胞在某一生理功能狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄的mRNA產(chǎn)物的集合，是基因組遺傳信息傳遞和表達(dá)的重要步驟和過(guò)程。其基本原理：提取樣本總RNA后，分離純化RNA。mRNA片段化處理，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄后連接測(cè)序接頭。DNA成簇?cái)U(kuò)增，使其達(dá)到一定豐度，獲得足夠的序列；高通量測(cè)序，獲得序列信息；數(shù)據(jù)分析，通過(guò)與參考基因組比對(duì)或從頭組裝形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得大量轉(zhuǎn)錄本序列信息，定量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。qPCR?array技術(shù)結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR以及基因芯片特點(diǎn)，每張qPCR芯片如同上百個(gè)qPCR微反應(yīng)池的集成，每個(gè)微反應(yīng)池都固定有基因特異性引物，當(dāng)加入含有模板和熒光基團(tuán)的qPCR反應(yīng)體系后，在相同的反應(yīng)條件下，不同的基因都能同時(shí)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，每個(gè)微反應(yīng)池的位置信息就代表了某個(gè)特定基因，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)微反應(yīng)池中PCR反應(yīng)的過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線就能同時(shí)對(duì)上百個(gè)基因的mRNA水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。它是一種高度靈敏和可靠的功能基因組研究方法。

現(xiàn)有的關(guān)于研究膽固醇代謝基因表達(dá)的方法，大都是基于表達(dá)譜芯片，RNA測(cè)序。但是這兩種方法具有以下缺點(diǎn)：表達(dá)譜芯片中并沒有準(zhǔn)確的定量信息，結(jié)果需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；表達(dá)譜芯片是一種廣譜的篩選方法，其并沒有針對(duì)性研究基因，許多與研究對(duì)象無(wú)關(guān)的基因會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用或錯(cuò)誤的信息，干擾結(jié)果分析；RNA-Seq能夠檢測(cè)樣品中的所有RNA，而細(xì)胞中很大一部分RNA都來(lái)自核糖體和線粒體，限制了其他RNA的讀取數(shù)量以及這些RNA表達(dá)水平的準(zhǔn)確性。同時(shí)這兩種方法，科研花費(fèi)高，并且只能在專業(yè)實(shí)驗(yàn)中心完成。不具備在普通實(shí)驗(yàn)室完成的條件。而qPCR?array技術(shù)具有實(shí)時(shí)定量PCR的精確定量以及基因芯片的高通量檢測(cè)技術(shù)與功能分類的優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)準(zhǔn)確定量分析上百個(gè)基因；實(shí)驗(yàn)周期短，數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單；花費(fèi)少，且不需要專門的實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢測(cè)，只要擁有一臺(tái)定量PCR儀，其可以在任何一間普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。所以，其是一種高度靈敏和可靠的功能基因組研究方法。

隨著功能基因組研究的逐步深入，qPCR芯片越來(lái)越受到重視，使用量逐年上升，成為了功能基因組研究的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測(cè)小鼠膽固醇代謝基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR芯片，該芯片能對(duì)小鼠膽固醇代謝相關(guān)基因進(jìn)行針對(duì)性分析，具有擴(kuò)增效率高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的一種用于檢測(cè)小鼠膽固醇代謝基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR芯片，該實(shí)時(shí)定量PCR芯片以與膽固醇代謝密切相關(guān)的88基因作為檢測(cè)位點(diǎn)，并選取了4個(gè)看家基因，所述的與膽固醇代謝密切相關(guān)的88基因、4個(gè)看家基因以及其對(duì)應(yīng)的引物如下：

與膽固醇代謝密切相關(guān)的88基因及其對(duì)應(yīng)的引物：

所述的4個(gè)看家基因及其對(duì)應(yīng)的引物如下：

所述的與膽固醇代謝密切相關(guān)的88基因和4個(gè)看家基因，共92個(gè)基因的上游引物和下游引物分別放置在96孔PCR板中。

所述的實(shí)時(shí)定量PCR芯片中還設(shè)有基因組DNA污染質(zhì)控和陰性對(duì)照，所述的實(shí)時(shí)定量PCR芯片中基因的排列方式如下：

其中E12和F12孔含有基因組DNA污染質(zhì)控，G12和H12則為陰性對(duì)照。