[發明專利]骨骼肌全器官脫細胞基質、制備方法及其衍生出的醫療產品

有效

• 申請號: 201410067736.0
• 申請日: 2014-02-26
• 公開（公告）號: CN103805555A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張劍;斯蒂芬·巴迪拉克;胡志前;王強;職康康;王妍妍;周海洋
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/36;A61L31/00;A61K35/34;A61P21/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟：取材對象的選擇、原材料的獲取和準備、前置處理、脫細胞、消毒保存、體外評估。

2.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述取材對象的選擇為，選擇血供明顯的異種異體骨骼??；取材范圍包括骨骼肌支配血管的上級血管；取材時間為取材部位骨骼肌仍具備有效血液循環時取材。

3.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述原材料的獲取和準備，其標準是確保骨骼肌內動靜脈系統均得到充分灌注、血液成分被排出而不會在骨骼肌小血管中凝結致微循環阻塞，此外灌注未導致骨骼肌內血管網絡破壞。

4.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述前置處理指明確所插管動脈支配的骨骼肌范圍、支配動脈有無解剖學變異，插管支配動脈的伴行靜脈，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪組織。

5.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述脫細胞步驟包括：將插管血管接入生物反應器，經支配血管按序列分批灌注不同處理液，標準是達到脫細胞要求、保留骨骼肌細胞外基質中80%以上的生物活性成分；其中，所述處理液包括酶處理液和化學藥物處理液。

6.根據權利要求5所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述酶處理液選自胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶或核酸外切酶/核酸內切酶中的一種或幾種；所述化學藥物處理液選自離子型、非離子型和兩性表面活性劑、螯合劑、高低滲溶液的一種或幾種。

7.根據權利要求6所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述核酸外切酶/核酸內切酶為脫氧核糖核酸酶，所述脫氧核糖核酸酶的終濃度為30-50U/ml；所述胰蛋白酶的終濃度為0.01～0.25%；α-半乳糖苷酶的終濃度為10-25U/ml；

所述化學藥物處理液選自乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、脫氧膽酸的一種或幾種，其中所述乙二胺四乙酸或乙二醇雙四乙酸的終濃度為0.02～0.5%，所述十二烷基硫酸鈉的終濃度為0.01～0.1%，所述聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為0.1～1%，所述脫氧膽酸的終濃度為0.5～2%。

8.根據權利要求7所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述分批灌注的處理液選自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸、脫氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚和脫氧膽酸的幾種，其中所述胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸的作用時間為1-3小時，脫氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶的作用時間為0.4-1小時，十二烷基硫酸鈉的作用時間為4-24小時、聚乙二醇辛基苯基醚的作用時間為8-24小時、脫氧膽酸的作用時間4-24小時。

9.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述消毒保存中的消毒方法選自全灌注系統預滅菌、全程使用滅菌液體灌注、制備后消毒液灌注，或輻射滅菌的一種或幾種；所述消毒保存中的保存技術選自水化保存或干燥體保存。

10.根據權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述體外評估包括：檢測骨骼肌全器官脫細胞基質的組織學、超微結構，檢測殘留核酸、內毒素含量和殘留核酸鏈的長度，測定生物負載以及殘留脫細胞化合物含量，檢測骨骼肌基底膜特異性成分的存在，測定促干細胞粘附、增殖和分化成分的含量。

11.根據權利要求10所述的骨骼肌全器官脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述骨骼肌基底膜特異成分包括IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白，所述促干細胞粘附、增殖和分化成分包括透明質酸、糖胺聚糖、硫酸類肝素和生長因子。