[發(fā)明專利]乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410067612.2
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103837689B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏成;吳凌;徐闖;鄭家三;段宇;包凱;孫雨航;李穎;許楚楚;高陽;張洪友;包軍
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用。

背景技術(shù)

孕酮是一種小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，要使孕酮具有完全抗原性，一般利用某種偶聯(lián)劑作為橋聯(lián)，將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)而成為完全抗原。孕酮免疫生物傳感器以高親和力、靈敏度和高特異性的單克隆抗體為基礎(chǔ)，獲得高親和力、高特異性的細胞株是獲得單克隆抗體的關(guān)鍵。單克隆抗體在當前系統(tǒng)中使用極為敏感，而且具有比較高的專一性，提高了檢測孕酮激素準確率。本發(fā)明重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化。

在國外孕酮的檢測成為牛群繁殖管理的重要檢測指標之一，孕酮測定被主要用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測和早期妊娠狀態(tài)的評價。通過孕酮檢測，區(qū)分出已孕奶牛、休情期奶牛或發(fā)情周期不規(guī)律的奶牛，以便迅速采取適當?shù)拇胧?。本發(fā)明應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對妊娠奶牛、發(fā)情奶牛和繁殖障礙奶牛進行了檢測，并用ELISA檢測方法進行了對比，為奶牛妊娠、發(fā)情和繁殖障礙疾病的診斷提供了新的判定標準和理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用，重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化，對妊娠奶牛、發(fā)情奶牛和繁殖障礙奶牛進行了檢測，并用ELISA檢測方法進行了對比，為奶牛妊娠、發(fā)情和繁殖障礙疾病的診斷提供了新的判定標準和理論依據(jù)。

本發(fā)明的一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立，具體步驟如下：

步驟一：準備材料：紫外可見分光光度計、精密電子天平、CHI660A電化學(xué)工作站、恒溫箱、磁力攪拌器、孕酮-11α-半琥珀酸酯、孕酮單克隆抗體、HRP山羊抗小鼠酶標二抗體；3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-2HCL、牛血清白蛋白(BSA)、H₂O₂、Tween20、孕酮(P4)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，二甲基甲酰胺(DMF)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、卵清白蛋白(OVA，MW：45000)、透析袋、96孔可拆酶標板

步驟二：完全檢測抗原的制備：

(1)稱取1mg11α-羥基孕酮半琥珀酸(11α-OH-P₄-HS)，溶于0.02mL二甲基甲酰胺(DMF)中；分別稱取0.0298mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.534mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，各自溶于0.004mLDMF中；將上述三種溶液混合，在室溫下振蕩90min；將振蕩均勻的混合液逐滴緩慢地加入溶解于含有2.1mg卵清白蛋白(OVA)的0.2mol／L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)中，然后4℃攪拌過夜；將偶聯(lián)的液體裝入預(yù)先處理好的透析袋中，放入大燒杯中透析；在透析過程中用0.1MNaHCO₃2.2L，透析4小時；去離子水2.2L×3次，透析1.5h×3次；最后用1LPBS(pH7.4)透析15小時。取出偶聯(lián)物11α-OH-P₄-HS-OVA，4000rpm，離心30min，取上清分裝，在-20℃凍存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

(2)分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11α-OH-P₄-HS-OVA)，卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11α-半琥珀酸酯(11α-OH-P₄-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性。

(3)用紫外掃描儀測定上述完全抗原制備液的OD_260nm和OD_280nm值，以計算蛋白濃度。蛋白濃度mg/mL=(1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm)×稀釋倍數(shù)。

步驟三：分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11α-OH-P₄-HS-OVA)，卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11α-半琥珀酸酯(11α-OH-P₄-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性。