[發(fā)明專利]一種sgRNA片段及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410067479.0
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103820452A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭敦武;黎妃鳳;劉津;歐陽應(yīng)斌;俞曉峰
• 申請（專利權(quán)）人: 賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 劉燕嬌

1.一種sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和一段DNA識別序列，其中，所述DNA識別序列是可與目的基因兩條鏈中的一條鏈堿基互補的DNA序列，所述固定序列為GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT?GAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA片段的DNA序列具有如下結(jié)構(gòu)：5’Xy-NGG-固定序列-3’，其中X代表A、T、C、G四個堿基中任意一個，y代表DNA識別序列長度，長度為19-21bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種sgRNA片段，其特征在于，所述DNA識別序列其堿基序列如SEQ?ID?NO.2～SEQ?ID?NO.343。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種sgRNA片段，其特征在于，所述NGG為sgRNA片段通過識別目的基因的PAM位點，其中N代表A、T、C、G中任意一個。

5.一種含有sgRNA片段的表達載體，其特征在于，該表達載體含有權(quán)利要求1所述的sgRNA片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為pCR-Blunt?II-TOPO載體。

7.一種基因敲除方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的sgRNA片段可識別目的基因上的雙鏈上的不同靶位點，可與一種核酸酶結(jié)合并通過識別靶位點處PAM序列，引導核酸酶結(jié)合到目的基因靶位點處，并開始進行隨機剪切，隨后從切口處脫落，形成DSB缺口，隨后細胞通過非同源末端連接修復(fù)機制修復(fù)目的基因雙鏈，造成移碼突變，最終目的基因被敲除。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述基因敲除方法，其特征在于，所述的sgRNA片段與核酸酶發(fā)揮作用的數(shù)量為一個或以上。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因敲除方法，其特征在于，所述sgRNA的表達盒由U6啟動子和所述的sgRNA片段的DNA序列，及一段終止序列TTTTTT組成；所述的sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和可與目的基因兩條鏈中的一條鏈堿基互補的DNA識別序列組成。

10.一種基因打靶試劑盒，其特征在于，包括如下（1）和（2）：

（1）權(quán)利要求1所述的sgRNA片段；權(quán)利要求5所述的含有sgRNA片段的表達載體；

（2）含有如下表達載體，但不僅限于下列表達載體：DNA片段的重組克隆載體：依次由U6啟動子、AflII酶切位點和sgRNA完整堿基序列及一段終止序列TTTTTT依次連接而成。