[發(fā)明專利]大腦皮層神經(jīng)元分離和原代培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410066546.7
• 申請(qǐng)日: 2014-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN103789266A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉洛賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉洛賢
• 主分類號(hào): C12N5/0793
• 分類號(hào): C12N5/0793;C12R1/01
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大腦皮層細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)方法及試劑。

背景技術(shù)

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，是一種已經(jīng)高度分化的細(xì)胞，在哺乳動(dòng)物出生后很少分裂，因此對(duì)神經(jīng)元的提取有很大的困難。神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如大腦皮層組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經(jīng)叢從機(jī)體直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國(guó)內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，動(dòng)物出生后很少分裂，相對(duì)于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長(zhǎng)。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營(yíng)養(yǎng)條件均較為特殊。

目前，導(dǎo)致難以獲得足夠數(shù)量和活力的原代大腦皮層細(xì)胞元的因素有以下幾方面：(1)大腦皮層細(xì)胞組織分離過程中，多數(shù)人用D-hank′s或hank′s作為漂洗液，離體哺乳動(dòng)物大腦皮層組織中去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分離過程時(shí)間較長(zhǎng)，有時(shí)候需要2小時(shí)以上，在漂洗液中時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，大腦皮層細(xì)胞元即已部分死亡，從而出現(xiàn)假陰性的培養(yǎng)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)上無法開展大腦皮層細(xì)胞元的常規(guī)培養(yǎng)，主要可能是因?yàn)闆]有合適的用于大腦皮層組織標(biāo)本的神經(jīng)元培養(yǎng)用漂洗液／解剖液之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經(jīng)元依然進(jìn)行著很大程度代謝，hank′s液的無糖環(huán)境對(duì)神經(jīng)元分離很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)；添加DMEM培養(yǎng)液會(huì)堿性化，不利于神經(jīng)元細(xì)胞存活。中國(guó)專利CN102978162A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑”、中國(guó)專利CN102994452A“一種高效分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法”和中國(guó)專利CN102994451A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法”，取腦組織放入盛有1×PBS的培養(yǎng)皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經(jīng)元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質(zhì)，葡萄糖濃度太高，就容易增加細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，大腦皮層細(xì)胞勢(shì)必受到相當(dāng)程度的生比和機(jī)械損害；細(xì)胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對(duì)于這類具有立體結(jié)構(gòu)用以維持細(xì)胞增殖及自我更新的細(xì)胞來說，很難迅速恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)，往往伴隨著大范圍的細(xì)胞死亡／凋亡，細(xì)胞“老化”嚴(yán)重，細(xì)胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細(xì)胞；(3)細(xì)胞種植液對(duì)原代培養(yǎng)大腦皮層細(xì)胞元至關(guān)重要，細(xì)胞種植液不同于接下來的細(xì)胞維持液，需要給予神經(jīng)細(xì)胞特殊的生長(zhǎng)因子，這樣才能保證獲得足夠數(shù)量和活力的大腦皮層細(xì)胞元。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物的大腦皮層細(xì)胞元體外原代培養(yǎng)的方法，目的是建立一種簡(jiǎn)單易行、高純度的大腦皮層細(xì)胞元體外原代培養(yǎng)的方法及試劑，滿足神經(jīng)科學(xué)研究的需求。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為：

本發(fā)明的雙歧桿菌(Bifidobacterium?sp.)WZ002，已于2014年1月22日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(Bifidobacterium?sp.)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8809。

本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。

本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002菌株具有下述微生物學(xué)特征：

(1)菌落形態(tài)：WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1～1.5mm。

(2)個(gè)體形態(tài)：G+無芽孢桿菌，桿狀。

(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纖維二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸鈉(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麥芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水楊素(-)；F6PPK酶(+)；對(duì)氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長(zhǎng))；硝酸鹽還原(-)；觸酶(-)；靛基質(zhì)反應(yīng)(-)。

厭氧下生長(zhǎng)良好，有氧環(huán)境中不生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度37～41℃；最低生長(zhǎng)溫度25～28℃；最高43～45℃；生長(zhǎng)最適pH6.5～7.0；在pH4.5～5.0或8.0～8.5不生長(zhǎng)。