[發(fā)明專利]高效分離和培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410066483.5
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103789265A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉洛賢
• 申請（專利權(quán)）人: 劉洛賢
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種海馬神經(jīng)細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)方法及試劑。

背景技術(shù)

海馬(hippocampal)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，作為神經(jīng)元高度集中的區(qū)域，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及自主神經(jīng)功能等方面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機制等重要的實驗?zāi)Ｐ停w外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元已成為研究阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的重要技術(shù)手段。原代培養(yǎng)(primary?culture)是指從活體細(xì)胞獲得細(xì)胞、組織或器官，在體外條件下進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如海馬組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經(jīng)叢從機體直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，動物出生后很少分裂，相對于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。

目前，導(dǎo)致難以獲得足夠數(shù)量和活力的原代海馬神經(jīng)元的因素有以下幾方面：(1)海馬神經(jīng)組織分離過程中，多數(shù)人用D-hank′s或hank′s作為漂洗液，離體哺乳動物海馬組織中去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分離過程時間較長，有時候需要2小時以上，在漂洗液中時間會更長，海馬神經(jīng)元即已部分死亡，從而出現(xiàn)假陰性的培養(yǎng)結(jié)果。實驗上無法開展海馬神經(jīng)元的常規(guī)培養(yǎng)，主要可能是因為沒有合適的用于海馬組織標(biāo)本的神經(jīng)元培養(yǎng)用漂洗液/解剖液之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經(jīng)元依然進(jìn)行著很大程度代謝，hank′s液的無糖環(huán)境對神經(jīng)元分離很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細(xì)菌污染的機會；添加DMEM培養(yǎng)液會堿性化，不利于神經(jīng)元細(xì)胞存活。中國專利CN102978162A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑”、中國專利CN102994452A“一種高效分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法”和中國專利CN102994451A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法”，取腦組織放入盛有1×PBS的培養(yǎng)皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經(jīng)元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質(zhì)，葡萄糖濃度太高，就容易增加細(xì)胞污染的機會。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，海馬神經(jīng)細(xì)胞勢必受到相當(dāng)程度的生比和機械損害；細(xì)胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結(jié)構(gòu)用以維持細(xì)胞增殖及自我更新的細(xì)胞來說，很難迅速恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)，往往伴隨著大范圍的細(xì)胞死亡/凋亡，細(xì)胞“老化”嚴(yán)重，細(xì)胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細(xì)胞；(3)細(xì)胞種植液對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元至關(guān)重要，細(xì)胞種植液不同于接下來的細(xì)胞維持液，需要給予神經(jīng)細(xì)胞特殊的生長因子，這樣才能保證獲得足夠數(shù)量和活力的海馬神經(jīng)元。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種哺乳動物的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法，目的是建立一種簡單易行、高純度的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法及試劑，滿足神經(jīng)科學(xué)研究的需求。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為：

本發(fā)明的短雙歧桿菌(Bifidobac?terium?breve)LJM-006，已于2011年10月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌(Bifidobac?terium?breve)，保藏編號為CGMCC?No.5418。

本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006分離于一名浙江省健康青年人糞便中。

本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006菌株具有下述微生物學(xué)特征：

(1)菌落形態(tài)：短雙歧桿菌菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1～1.5mm。

(2)個體形態(tài)：G⁺無芽孢桿菌，桿狀。