[發(fā)明專利]共表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶模型的構(gòu)建及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410066266.6
• 申請(qǐng)日: 2014-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN103881977A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾蘇;趙壘;胡海紅;余露山;蔣惠娣;周惠;徐思云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N15/53;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種共表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）以人基因OAT1?cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)含EcoR?I和NheI雙酶切位點(diǎn)的特定引物SEQ?ID?No:3和SEQ?ID?No:4，擴(kuò)增得到人OAT1基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQ?ID?No:1所示，經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3.1(+)片段，通過T4連接酶連接，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/OAT1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，測(cè)序；測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，經(jīng)過氨基糖苷類抗生素G418篩選出單克隆細(xì)胞，得到穩(wěn)定高表達(dá)OAT1的MDCK細(xì)胞；

（2）然后從冰凍人肝組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得人的cDNA文庫，以該cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)含有BamH?I和Nhe?I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特定引物SEQ?ID?No:5和?SEQ?ID?No:6，擴(kuò)增得到人CYP1A2基因片段NM_000761,其核苷酸序列如SEQ?ID?No:2所示；

（3）經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和帶有潮霉素B篩選標(biāo)記的載體pcDNA3.1/Hygro(+)片段，通過T4連接酶連接，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，測(cè)序；

（4）測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)染MDCK-hOAT1細(xì)胞，經(jīng)過潮霉素B篩選，得到共表達(dá)OAT1和CYP1A2細(xì)胞，進(jìn)行mRNA驗(yàn)證并通過經(jīng)典底物對(duì)氨基馬尿酸及抑制劑丙磺舒進(jìn)行OAT1的功能驗(yàn)證以及通過經(jīng)典底物非那西丁進(jìn)行CYP1A2的功能驗(yàn)證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶細(xì)胞模型的構(gòu)建方法在OAT1和CYP1A2底物或抑制劑初步篩選中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶細(xì)胞模型的構(gòu)建方法在考察OAT1和CYP1A2底物或抑制劑在介導(dǎo)藥物的細(xì)胞毒性中的作用。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：加入一定濃度的待測(cè)藥物，孵育一定時(shí)間，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目變化，將細(xì)胞用PBS緩沖液洗兩次，加入甲醇固定15min，加入0.5μmol/L?DAPI染色液室溫避光作用15min，將染色后的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)和數(shù)量變化，加入0.5mg/mL?MTT繼續(xù)孵育4h，加入200μL?DMSO孵育10min，于酶標(biāo)儀570nm處讀取吸光度值，吸光度值越小，細(xì)胞成活量越低，表明待測(cè)藥物毒性越大。