[發(fā)明專利]一種生物殺菌劑及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410065238.2
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103834704A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 劉書延;張紅艷
• 申請（專利權）人: 河北三農農用化工有限公司
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C07D241/46;A01P3/00;A01P1/00;C12R1/38
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術領域

本發(fā)明屬于微生物技術領域，涉及一種生物殺菌劑及其制備方法，尤其是涉及一種生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)及其制備方法。?

背景技術

生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)主要來源于綠針假單胞菌株的次生代謝產(chǎn)物，具有廣譜抗病性和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，被認為是一種天然的、具有高效抑制植物病原菌的抗菌物質。具有強烈的抗真菌特性，也抑制部分細菌的活性。但是目前還沒有N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼作為生物殺菌劑及其制備方法方面的報道。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種生物殺菌劑及其制備方法。?

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑為N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由綠針假單胞菌屬菌株的遺傳改良菌株SN36培養(yǎng)制得，所述的菌株SN36在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.7846；保藏時間：2013-7-03，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類命名：綠針假單胞菌Pseudomonas?chlororaphis。?

一種生物殺菌劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：將綠針假單胞菌屬菌株的遺傳改良菌株SN36在液體培養(yǎng)基中進行二級發(fā)酵培養(yǎng)，其中第一級為種子液培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基A，第二級為發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基B；在接種種子液前，加入黏稠劑，以達到細胞富集培養(yǎng)，減少發(fā)酵過程泡沫產(chǎn)生，增加IturinA及其同系物產(chǎn)量的目的。接種種子液后，進行發(fā)酵培養(yǎng)和流加補料液C的補料發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結束后，從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集生物農藥N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。?

所述的培養(yǎng)基和補料液具體組分按g/m1計為：?

液體培養(yǎng)基A：葡萄糖0.8％-6.0％，蛋白胨0.4％-6.0％，牛肉膏0.2％-3.0％，硫酸鎂0.06％-1.0％，磷酸二氫鉀0.2％-1.0％；?

液體培養(yǎng)基B：玉米淀粉2.0％-10.0％，黃豆粉3.0％-12.0％，黃豆芽汁5.0％-15.0％，硫酸鎂0.1％-1.2％，磷酸二氫鉀0.4％-1.5％；?

補料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀釋液。?

所述的黏稠劑為明膠、瓊脂、可溶性淀粉、糊精、黃原膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉CMC中的一種或幾種；添加黏稠劑的濃度范圍為0.1-100.0g/L發(fā)酵液。?

所述的黏稠劑的濃度范圍為0.5-20.0g/L發(fā)酵液。?

所述的黏稠劑的流加補料液C的方式為連續(xù)流加方式或間歇式流加方式。?

所述的黏稠劑的連續(xù)流加方式為勻速或非勻速連續(xù)流加方式，以0.01-5.0L/h的速度連續(xù)流加補料液C，直至停止發(fā)酵前8小時。?

所述的黏稠劑的間歇式流加的間歇時間為每隔3-24小時補料1-6次，每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.01％-1.0％。?

所述的黏稠劑的間歇式流加每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.1％-0.5％。?

所述的二級發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為26℃-37℃，pH為6-8，時間為3-6天。?

發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值至2-5，或者用飽和度在40％-70％的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)洗脫液，經(jīng)濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固體形式析出，經(jīng)收集，洗滌，干燥，即得生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)產(chǎn)品。?

采用高效液相色譜法檢測生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用條件：色譜柱C1810.7φ°-250mm；流動相為45％乙腈∶水∶10mM醋酸銨；流速1mL/min；檢測波長280nm。?

采用本發(fā)明工藝，在第二級發(fā)酵時，液體培養(yǎng)基只流加補料而不用出料，可以維持發(fā)酵工藝需求的較好的碳氮比；通過采用一定比例的黏稠劑，提高發(fā)酵體系中細菌細胞的濃度，實現(xiàn)較高密度的發(fā)酵，大大減少發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫，有利于控制溶解氧濃度、溫度等技術參數(shù)，從而提高生物殺菌劑(N-鄰氯苯乙酰-N-吩嗪-1-?甲酰肼)的產(chǎn)量。?