[發(fā)明專(zhuān)利]一種單克隆抗體的生物學(xué)活性測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410064974.6
• 申請(qǐng)日: 2014-02-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103792200A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何偉;劉永清;喻志愛(ài);白先宏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 百泰生物藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31;G01N33/577
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體的生物學(xué)活性測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及重組抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體的生物學(xué)活性測(cè)定方法。

背景技術(shù)

表皮生長(zhǎng)因子受體（Epithelial?growth?factor?receptor，EGFR）是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，其信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用（Hanley?SC，Assouline-Thomas?B，Makhlin?J，et?al.J?Endocrinol，2011，211（3）：231-239）。研究表明，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)，因此可將EGFR作為腫瘤治療的靶點(diǎn)（Kim?H，Kim?SH，Kim?MJ，et?al.J?Immunother，2011，34（4）：372-381；Oh?M，Lee?JY，Shin?DH，et?al.Cancer?Sci，2011，102（3）：597-604）。

單克隆抗體的生物學(xué)活性測(cè)定是重組生物制品質(zhì)量控制的重要評(píng)價(jià)參數(shù)，關(guān)系到單克隆抗體的治療效果。一般將體外細(xì)胞增殖抑制方法測(cè)得的生物學(xué)活性稱(chēng)為單抗的效價(jià)。

早在1963年，Slater就發(fā)現(xiàn)了線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶)可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開(kāi)，生成藍(lán)色的產(chǎn)物甲(formazan)。根據(jù)這個(gè)原理，Mosmann（Mosmann?T.J?Immunol?Methods,1983,65:55）于1983年創(chuàng)立了MTT檢測(cè)法，此法在測(cè)定細(xì)胞的存活和增殖方面非常有效，因?yàn)檫@種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細(xì)胞中，并且甲的形成量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前，MTT測(cè)定法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-2等的檢測(cè)工作中。

目前通用的重組抗人EGFR抗體生物學(xué)活性的測(cè)定方法，是采用DiFi細(xì)胞或者M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞的增殖/WST比色法，均采用改進(jìn)的MTT染色的方法。該法依據(jù)抗EFGR抗體對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，DiFi細(xì)胞或者M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀況因重組抗EGFR抗體的生物學(xué)活性的不同而異，以此檢測(cè)抗EGFR抗體的生物學(xué)活性。其測(cè)定法分別為：

（1）DiFi細(xì)胞增殖比色法：DiFi細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)，1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，胎盤(pán)藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁵個(gè)/ml，100μl/孔，振蕩器混勻5分鐘后，將96孔板置37℃、5%CO₂孵箱孵育90-102小時(shí)，孵育結(jié)束前將CellTiter96Aqueous?Non-Radioactive?Cell?Proliferation?Assay?MTS試劑盒中的PMS和MTS融化并平衡至室溫后，取100ul?PMS加入2mlMTS中，混勻，加入細(xì)胞培養(yǎng)板，20ul/孔，37℃、5%CO₂孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，加入10%SDS15ul/孔終止顯色，490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，結(jié)果使用Softmax5.0軟件分析（張峰等，DiFi細(xì)胞增殖抑制法測(cè)定抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性，第五次全國(guó)免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C],2011年）。

（2）MDA-MB-468細(xì)胞增殖/WST比色法：MDA-MB-468細(xì)胞用稀釋液（含0.1g/L?PF-68的F12/DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞濃度調(diào)整至（5～8）×10⁴個(gè)／mL，加入96孔板，每孔100μL，空白對(duì)照加入100μL稀釋液。用樣品稀釋液（含0.2%FBS的F12／DMEM培養(yǎng)基）將樣品和參考品預(yù)稀釋至50μg/mL，再3倍梯度稀釋至0.023μg／mL，加入96孔板，每孔50μL，補(bǔ)加40μLF12/DMEM培養(yǎng)基（含5%FBS），37℃培養(yǎng)5天，加入30μL?WST-8顯色液，繼續(xù)孵育4h，以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度（A）值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合，得到反“S”型曲線，以半數(shù)有效濃度（EC₅₀）表示生物學(xué)活性。將50μg／mL的樣品與參考品等體積混勻，按相同方式稀釋并加樣，測(cè)定回收率，按下式計(jì)算相對(duì)生物學(xué)活性和回收率（陶磊等，人源化抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體質(zhì)控方法的建立，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013年01月第26卷第1期）。