[發明專利]香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410064946.4
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103789443A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 林壁潤;張景欣;沈會芳;蒲小明;潘群英
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提供兩對檢測引物，如下所示：

香蕉枯萎病菌上游特異引物Foc-F：5'-TTCGGCGATAACTTCAATGTCA-3'；

香蕉枯萎病菌下游特異引物Foc-R：5'-TGGGTTGCGGATTCGCTATT-3'；

細菌性軟腐病菌上游特異引物GyrB-F：5'-AATACGACATTCTGGCTAAGCG-3'；

細菌性軟腐病菌下游特異引物GyrB-R：5'-GATTTCCACGCCGATATTGTCT-3'；

（2）對樣本進行處理，抽提樣本DNA；

（3）以樣本DNA為模板，使用香蕉枯萎病菌上游、下游特異引物和細菌性軟腐病菌上游、下游特異引物進行多重PCR擴增反應；

（4）將擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；當PCR產物呈現636bp條帶時，即樣本中含有香蕉枯萎病菌1號生理小種病原菌；當PCR產物呈現796bp條帶時，即樣本中含有香蕉枯萎病菌4號生理小種病原菌；當PCR產物呈現218bp條帶時，即樣本中含有細菌性軟腐病原菌。

2.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：步驟（2）中所述的樣本為香蕉病原菌時，所述處理的方式為利用FPCB?solution抽提培養過濾后的真菌菌絲的DNA；利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。

3.根據權利要求2所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：所述的過濾為用擦鏡紙或濾紙進行過濾。

4.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：步驟（2）中所述的樣本為香蕉植株組織時，所述處理的方式為利用CTAB法抽提香蕉植株組織中的DNA。

5.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：步驟（2）中所述的樣本為土壤時，所述處理的方式為使用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取疑感染的土壤DNA。

6.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：步驟（3）所述的多重PCR擴增反應的反應條件為94℃預變性5min；94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，35個循環；72℃延伸10min。

7.根據權利要求1所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法，其特征在于：

步驟（3）所述的多重PCR擴增反應的體系20μL如下：DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR?buffer2μL，2.5mM的dNTP1.6μL，10μM的Foc-F0.3μL，10μM的Foc-R0.3μL，10μM的GyrB-F0.3μL，10μM的GyrB-R0.3μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，ddH₂O14μL，共20μL。

8.權利要求1～7任一項所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法應用于香蕉種苗檢疫、土壤病原菌檢測、田間香蕉病害的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。

10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重分子快速檢測方法應用于香蕉患病組織的檢測，患病組織上直接分離的病原真菌或細菌的鑒定及檢測，土壤中香蕉枯萎病菌不同生理小種、細菌性軟腐病菌的檢測。