[發明專利]結核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關的新突變位點及其應用

有效

• 申請號: 201410064833.4
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103820439B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 周琳;鐘球;畢利軍;郭卉欣;陳濤;李海成;陳亮;陳瑜暉;蔣莉;舒楊;王威
• 申請（專利權）人: 廣東省結核病控制中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明涉及結核分枝桿菌耐藥堿基突變位點的高通量篩選和驗證，具體涉及一種結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變位點的篩查和驗證。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結核病。到20 世紀80 年代后期，由于貧困、艾滋病、人口流動和耐藥等因素，結核病發病率和死亡率在全球范圍內出現快速回升，成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴重的傳染病。結核分枝桿菌耐藥情況嚴重，耐藥率高達46％，給結核病的預防和治療構成嚴峻挑戰。

抗結核藥物是結核病化學治療的基礎，而結核病的化學治療是人類控制結核病的主要手段。鏈霉素發現于20 世紀40 年代，是最早出現的有效抗結核的氨基苷類抗生素藥物，也是治療結核病的一線藥物之一。鏈霉素是一種氨基環醇糖苷類抗生素，主要作用于結核分枝桿菌的核糖體，與結核分枝桿菌的核糖體30S 亞單位結合，誘導遺傳密碼的錯配，破壞翻譯過程的正常進行，合成結構功能異常的蛋白從而發揮其殺菌作用。鏈霉素經常單獨給藥，因此其耐藥性發展較快。結核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機制是編碼小亞基的S12 蛋白的rpsL 基因和編碼16S 核糖體RNA 的rrs基因突變，從而抑制藥物結合核糖體的能力，造成對鏈霉素耐藥。目前所知的結核分枝桿菌的耐鏈霉素藥的原因，主要是由基因rpsL第43位堿基發生A→G的突變。結核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測對于正確選擇有效的抗結核化療方案，有效控制耐藥性結核分枝桿菌的傳播以及控制結核病有極其重要的意義。

目前臨床上采用的耐藥檢測方法可分為表型檢測和基因型檢測兩類，并以前者為主。然而表型檢測因為各種原因，如耗時、設備昂貴、有放射性危害或干擾因素多等，難以形成快速高效的篩查手段。相對而言，基因檢測更為直接，目前已經使用的基因分析方法有單鏈構象多態性分析法(SSCP)，限制性片段長度多態性分析法(RFLP)，DNA 測序法，線性探針雜交法，RNA/RNA 錯配分析法，以及DNA 陣列( 芯片) 檢測等。這些方法主要利用基因rpsL第43位堿基的A→G突變的標準，檢測樣品結核分枝桿菌是否發生同樣的突變，從而快速判斷結核分枝桿菌是否具有鏈霉素耐藥性，但仍有許多耐鏈霉素的結核分枝桿菌不能被檢測出來，呈假陰性。

結核病耐藥率高是造成結核病疫情難以控制的重要原因，而傳統的結核分枝桿菌藥敏試驗費時長，影響患者診治，增加耐藥株擴散機會，那么有效提高分子生物學方法快速鑒定結核分枝桿菌耐藥性的檢出率和準確率具有重要意義。較高的結核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢出率，對臨床耐藥性檢測和用藥具有指導意義。

發明內容

本發明的目的在于提供結核分枝桿菌鏈霉素耐藥新突變位點。

本發明的另一目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測試劑盒。

本發明的再一目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測膜。

本發明的再一目的在于提供一種結核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的快速篩查法。

本發明所采取的技術方案是：

一種結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變位點，該突變位點位于標準株H37Rv基因組的第1338631位，即基因間區Rv1194c-Rv1195的第47位，發生的點突變為堿基C替換為A。

一種檢測結核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測試劑盒，該試劑盒含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區Rv1194c-Rv1195的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO : 1或其堿基互補序列。

一種檢測結核分枝桿菌耐藥突變堿基的檢測膜，該膜含有用于檢測鏈霉素耐藥突變基因間區Rv1194c-Rv1195的特異性寡核苷酸探針，其堿基序列如SEQ ID NO : 1或其堿基互補序列。

一種結核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的快速篩查法，該方法利用PCR擴增法檢測基因間區Rv1194c-Rv1195第多少位的堿基。

本發明的有益效果是：

本發明發現的鏈霉素耐藥突變位點提高了結核分枝桿菌耐鏈霉素的分子檢測水平，陽性檢出率在原有的基礎上增加了22.22%，能夠有效縮短患者的診斷時間，節約患者治療時間和費用。

本發明發現結核菌耐藥突變位點不僅發生在編碼區，同時也可能發生在非編碼區，提示基因間區（IGR）的堿基突變可能也與耐藥相關，即IGR區也存在耐藥生物標志物。該發明為找到新的、更有效的結核病耐藥分子標識物提供了一種新的思路。

附圖說明