[發明專利]一種測定細胞活力的方法、試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201410064711.5
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103808678A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張成崗;何國維;李偉光;高艷;李志慧;高大文
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;蘇州科景生物醫藥科技有限公司;北京百樂寧生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N15/10
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術領域

本發明屬于生物技術領域中細胞活力的測定方法，特別是涉及一種利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)測定細胞活力的方法，該方法可用于測定貼壁及懸浮培養細胞的活力，比現有的基于3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉（XTT）及水溶性四氮唑（WSTs）等測定細胞活力的方法所獲得的結果更可靠，不容易受到檢測體系中抗氧化劑的干擾，從而能夠獲得更加科學、客觀、可靠的細胞活力的結果。

背景技術

在生物實驗中，為了測定某種刺激或藥物對細胞存活、增殖、生長抑制或毒性等指標的影響，經常需要測定細胞的活力。現有測定細胞活力的方法包括MTT法(Mosmann?T.Rapid?colorimetric?assay?for?cellular?growth?and?survival:application?to?proliferation?and?cytotoxicity?assays.J?Immunol?Methods,1983,65(1-2):55-63.)、XTT法(Scudiero?DA,Shoemaker?RH,Paull?KD,et?al.Evaluation?of?a?soluble?tetrazolium/formazan?assay?for?cell?growth?and?drug?sensitivity?in?culture?using?human?and?other?tumor?cell?lines.Cancer?Res.1988.48(17):4827-33.)及WSTs法(Ishiyama?M,Tominaga?H,Shiga?M,Sasamoto?K,Ohkura?Y,Ueno?K.A?combined?assay?of?cell?viability?and?in?vitro?cytotoxicity?with?a?highly?water-soluble?tetrazolium?salt,neutral?red?and?crystal?violet.Biol?Pharm?Bull.1996.19(11):1518-20.)等，均屬于四唑鹽還原法，原理為可自由透過細胞膜的水溶性四唑鹽被活細胞中的脫氫酶類還原成臜類物質，死細胞不能還原四唑鹽，臜類物質的生成量反映細胞活力，并與細胞數量成正比，通過計算可以得出細胞的相對存活率，增殖率，相對增值率等指標。其中，MTT法操作簡便、費用低廉，在細胞生物學實驗中較為常用，而XTT法及WSTs法生成的甲臜是可溶的，操作更加便捷，但由于這些檢測方法中使用的試劑價格較昂貴，對實驗的精確度亦沒有提升，因而在生物實驗中普及率不是很高，而且這些檢測方法最大的缺陷是所用的四唑鹽會被檢測體系中的多種還原劑(如L-抗壞血酸、黃酮類化合物、含巰基的抗氧化劑、血清白蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶、納米粒子、多酚類化合物)直接還原而被干擾，從而影響數據的精確性。因此，尋找一種能夠比較準確測定細胞活力的方法，對于準確地判定細胞活力具有重要意義和價值，避免檢測體系中由于多種抗氧化劑的存在而導致無法客觀估計出細胞的活力。本發明所提出的TTC檢測方法能夠很好地克服這一點。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium?chloride，簡稱TTC，分子式C₁₉H₁₅ClN₄)是一種生物學實驗中常用的四唑鹽，其用于已有生物學實驗中的機理為：TTC與活組織和細胞孵育后，可被細胞內的脫氫酶類催化還原生成紅色的甲臜(1,3,5-triphenyl?formazan，簡稱TPF，分子式C₁₉H₁₆N₄)而沉積在細胞和組織內，并使細胞和組織顯示紅色，而死的細胞和組織不能使其還原，則保持本來的透明或灰白色，其反應方程式如下：