[發明專利]周期型馬來絲蟲復合多價蛋白疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201410064467.2
• 申請日: 2014-02-25
• 公開（公告）號: CN103834687A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 方政;王慧;方浩;陸施娟;徐倩;胡迎青;童海燕;徐邦生
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/435;A61K39/00;C12N15/66;A61P33/10
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種周期型馬來絲蟲復合多價蛋白疫苗的制備方法，其特征是：包括下列步驟：

（一）周期型馬來絲蟲pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重組質粒的抽提：

(1)將含有重組質粒的菌種室溫融化后取50ul加入到含有50ul、100mg/ml氨芐西林鈉的100ml?LB溶液中置于37℃恒溫、250rpm的搖床培養12-16h，之后放置4℃冰箱冷卻；

(2)菌液培養12-16h后，使用紫外分光光度計測定其OD600值，OD600數值在0.6-0.8之間，表明細菌處于旺盛生長的對數生長期，則可以用來進行質粒的抽提；

(3)取上述培養后的菌至50ml離心管內，5000rpm離心1分鐘，收集沉淀，棄上清；

(4)每管加入5ml溶液I,重懸細胞沉淀；

(5)之后每管加入5ml溶液II，顛倒離心管4-6次，室溫放置3-5分鐘，使細菌完全裂解，溶液透明；

(6)每管加入5ml溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生，然后5000rpm室溫離心10-20分鐘；

(7)將上清倒入或吸入到質粒純化柱內，5000rpm室溫離心2分鐘，倒棄收集管內液體；

(8)在質粒純化柱內加入7ml溶液IV，5000rpm室溫離心2分鐘，洗去雜質，倒棄收集管內液體，之后再5000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發；

(9)將質粒純化柱置于50ml離心管上，加入2ml溶液V至管內柱面上，放置2分鐘，然后5000rpm室溫離心2分鐘，所得液體中加入10ml溶液VI混勻后加到原質粒純化柱內；

(10)再次室溫離心2分鐘后，倒棄收集管內液體；

(11)在質粒純化柱內加入15ml溶液IV，5000rpm室溫離心2分鐘，近一步洗去雜質后，倒棄收集管內液體；

(12)5000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發；

(13)將質粒純化柱置于50ml離心管上，加入2ml溶液V至管內柱面上，放置2分鐘；

(14)5000rpm室溫離心2分鐘，所得液體即為轉細胞級超純質粒；

(15)取DNA水溶液，用雙蒸水稀釋400倍，以雙蒸水作空白對照，在紫外分光光度計上讀取樣品的測定濃度及A260/A280的值，并將其貯存于-20℃用于基因轉染；

所述溶液I為質粒大量抽提試劑盒的懸浮液；溶液II為質粒大量抽提試劑盒的裂解液；溶液III為質粒大量抽提試劑盒的結合液；溶液IV為質粒大量抽提試劑盒的洗滌液；溶液V為質粒大量抽提試劑盒的洗脫液；溶液VI為質粒大量抽提試劑盒的DNA純化結合液；

（二）Hela細胞的復蘇、培養和傳代

(1)從-80℃冰箱中取出凍存Hela細胞的EP管，并直接投入37℃恒溫水浴鍋中，不時搖動使其融化；

(2)當完全融化時，從37℃溫水中取出EP管，1200轉/分，離心3分鐘；

(3)棄上清，用含有10％體積小牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養基重懸細胞沉淀，接種到培養瓶中，放在37℃、5%CO2細胞培養箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養；

(4)當Hela細胞長滿培養瓶底的70%～80%滿時，傳代，倒掉培養瓶中的培養液，用2ml?PBS緩沖液洗滌兩次；

(5)加入0.25%W/V胰酶lmL消化lmin，待瓶底細胞開始脫落時倒掉胰酶，加入8mL含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM完全培養基，用移液槍吹打瓶底細胞使其脫落并混勻，吸取4mL至另一培養瓶繼續培養；

（三）基因轉染

(1)提前24小時在96孔板中接種細胞55孔，每種濃度設5個復孔，接種量為使第二天長成25%單層，置CO2孵箱中37℃培養過夜；

(2)將培養液換成含抗生素G418的培養基，抗生素濃度按梯度遞增：0μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml和1000μg/ml；

(3)培養10-14天以絕大部分細胞死亡濃度為準，最后獲得最佳篩選濃度為400μg/ml，篩選穩定表達克隆時比該濃度提高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半；

(4)轉染前一天，將細胞用0.25%W/V胰酶消化、計數并鋪板，使其在轉染當天細胞融合度為80—90%，細胞鋪板在2mL含胎牛血清和雙抗的DMEM培養基中；在六孔板中按以下方式進行轉染，a、b作為對照：

a．DNA轉染空白對照

b．pcDNA3.1(+)

c．pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH；

(5)對于每孔細胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養基稀釋4ug～5ug?DNA，多孔操作時批量制備；

(6)對于每孔細胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養基稀釋10ul?Lipofect脂質體轉染試劑，Lipofect稀釋后，在5min內同稀釋的DNA混合，保溫時間過長會降低活性，可以批量制備；

(7)混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofect脂質體轉染試劑，在室溫保溫15min；

(8)使用2ml/孔的轉染培養基在轉染開始前洗滌細胞，轉染培養基更換為不含血清的DMEM培養基；

(9)將稀釋的復合物加入到細胞當中，搖動培養板，輕輕混勻在37℃、5%的CO2中保溫24-48h；

（四）陽性克隆的篩選

(1)轉染24小時后按1:10的比例將轉染細胞在6孔板中傳代，再培養24h后六孔板中的培養基更換為預試驗中確定的400μg/ml濃度的G418選擇培養基，然后按照下面不同生長情況的細胞用篩選培養基對陽性細胞進行篩選：

a．DNA轉染空白對照

b．pcDNA3.1(+)

c．pcDNA3.1(+)-BmCPI/GAPDH

加入按配制好的G418篩選培養基，篩選時比預實驗提高一個等級濃度；

(2)根據培養基的顏色和細胞生長情況，每2～3天更換一次篩選培養基；當觀察到a、b、c中大部分細胞大部分死亡或a中細胞全部死亡時，把培養基G418濃度減半維持篩選作為維持培養基，待其逐漸增大，此時血清濃度可加大為15%；

(3)當在顯微鏡下見到有陽性克隆形成時，準備挑取克隆；

（五）陽性克隆的提取和擴大培養

(1)觀察細胞克隆，用標記筆在培養板底面對要分離的陽性克隆做標記；

(2)撤去培養基，用PBS輕輕沖洗細胞克隆；

(3)用無菌鑷夾取一個克隆培養環，蘸取滅過菌的凡士林，凡士林面沖下，壓放在培養板中生長旺盛的陽性單克隆上，使凡士林均勻分布在克隆培養環底面，克隆環圈在所需克隆團上；

(4)在六孔板同一個孔上重復步驟(3)，用圈套2到3個其它所需克隆團；

(5)加0.25%胰酶充滿環內，20秒后棄去胰酶；

(6)蓋上六孔板，37℃，15分鐘；

(7)每個環中加0.1ml至0.2ml的培養基；

(8)依次對每個克隆用吸管吹打以分散細胞，并將細胞懸液分別移入24孔板的孔中，每個細胞克隆都應配備各自的吸管或槍頭；

(9)再用0.1ml至0.2ml的培養基沖洗克隆環，再將這些培養基分別移入相應的24孔板中；

(10)將培養孔中的培養基加至0.5ml，蓋好，繼續培養；

(11)當克隆細胞長滿24孔板時，即可消化傳代至六孔板中，加2ml培養基繼續擴大培養；

(12)六孔板中細胞長滿后即傳代至培養瓶繼續培養，直至凍存；

（六）陽性克隆的凍存

陽性克隆細胞（pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH）在篩選培養基中生長狀態穩定后開始對它們進行凍存：

(1)選取對數生長期的細胞，在凍存前一天更換一次培養基；

(2)倒掉培養基，PBS輕輕沖洗細胞克隆后，用0.25%W/V的胰酶消化細胞，把消化好的細胞收集于離心管中離心，倒掉培養基和胰酶；

(3)加入凍存液，凍存液中的細胞的最終濃度為5×10⁶，用移液槍吹打，然后分裝入細胞凍存管中封好，放入-80℃冰箱中凍存；所述凍存液包括10％體積分數的DMSO凍存培養基和10%體積分數的胎牛血清；

（七）檢測陽性克隆，抽提細胞總RNA，分子水平檢測重組質粒在細胞中的表達：

(1)六孔板中細胞棄上清，PBS清洗后每孔加入1ml?Trizol試劑，用移液槍吹打溶解細胞后移入新的1.5ml?Ep管中；

(2)15-30℃溫育5min，確保核蛋白復合物的徹底分離；

(3)加入0.1ml氯仿，充分振蕩15s，15-30℃溫育3min，2-8℃12000rpm離心15min；

(4)將上層液體轉移至另一Ep管內，加入0.3ml異丙醇，15-30℃溫育10min；2-8℃12000rpm離心10min；

(5)棄上清，用0.5ml75%DEPC-乙醇沖洗沉淀一次，2-8℃12000rpm離心15min。

(6)干燥5-10min，加入20μl?DEPC-DDW，55-60℃溫育10min，即為提取的RNA，保存于-80℃備用；

(7)逆轉錄合成cDNA第一鏈在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應混合物：

（1-5ug）總RNA；

2ul?oligo（dT）15；

2ul?dNTP（2.5mM?each）；

補RNase-free?ddH2O定容至14.5ul；

(8)70℃加熱5min后在冰上冷卻2min；簡短離心收集反應液后加入以下各組分：

4ul5×First-Strand?buffer(含有DTT)；0.5ul?RNasin。

(9)加1ul、200U的TIANScript?M_MLV，輕輕用移液器混勻。

(10)42℃溫溫50min；

(11)95℃加熱5min終止反應，置冰上進行后續實驗或-20度冷凍保存。

(12)PCR擴增基因；計算引物Tm值，P1?Tm=62.02,P2?Tm=64.94，在0.5m1?Eppendorf管中按下表建立25μl的PCR反應體系：

PCR反應體系

反應體系在冰上調制，混勻，離心后置PCR儀，94℃預變性3min后，94℃變性45秒；

57℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環，最后72℃再延伸7min，4℃冷卻終止反應；擴增完畢后，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

（八）蛋白水平檢測重組質粒在細胞中的表達

收集細胞中的蛋白，裂解蛋白的所有步驟都在冰上進行：

（1）從-20℃將RIPA裂解液取出融解，混勻；取裂解液，在使用前數分鐘加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM；

（2）去除培養液，用無血清培養液洗一遍，按照6孔板每孔加入200μl～250μl的比例加入裂解液，用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸；

（3）裂解后，15000rpm離心15min，取上清，置1.5ml滅菌離心管中；

（4）新收集細胞蛋白的EP管中加入等量loading?buffer，100℃煮沸5-10min，-20℃保存備用；

（九）表達產物進行SDS-PAGE分析

（1）配膠：分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。按下表依次加入各試劑并混勻，制膠。各樣品加入體積如下表：

分離膠組份配制（12%）

濃縮膠組份配制(5%)

將電泳玻璃板固定在夾子上，灌制分離膠于玻璃板夾層中，立即用異丙醇封頂壓膠，水平靜置，室溫聚合1h；倒去分離膠上層異丙醇，用濾紙吸掉多余液體，均勻加入濃縮膠，立即插入梳子，室溫聚合45min；

（2）上樣：濃縮膠凝聚后拔出梳子，將含有膠的雙層玻璃板置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，將蛋白質分子量標準參照物和樣品依次上樣；

（3）電泳：樣品側接負極，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓100V；需電泳4～6h，直到溴酚藍達分離膠底部；

（4）考馬斯亮藍染色：剝下凝膠，置于考馬斯亮藍染色液中，于搖床上搖動，振蕩染色約1～2h；

（5）將凝膠轉移到盛有脫色液的平皿中，于搖床上搖動，每15min換一次液，重復2～3次后，至背景無色，拍照觀察結果；

（十）周期性馬來絲蟲重組蛋白的提取和純化

①陽性克隆細胞的無血清培養

(1)對所有的陽性克隆細胞先用篩選培養基和維持培養基培養；

(2)當細胞單層長滿瓶底后，按1:2至1:4的比例進行傳代，之后換成5%血清濃度混合培養基；

(3)兩天至三天后，重復操作(2)，并依次逐步降低培養基中血清濃度，三到四次之后全換用無血清培養基；

(4)使用無血清培養基培養的細胞此時會開始懸浮生長并產生大大小小的細胞團；

(5)細胞團的產生對懸浮培養產生困擾，通過預實驗獲得5U/ml肝素鈉可以解決細胞結團的問題，因此，下次換液時改用含肝素鈉培養基并將細胞吹打均勻，使細胞完全懸浮生長；

(6)培養后，保留細胞培養上清，待下一步對細胞和細胞培養上清中的目的蛋白進行純化；

②粗提蛋白

(1)從-20℃將RIPA裂解液取出融解，混勻；取裂解液，在使用前數分鐘加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM；

(2)去除培養液，用無血清培養液洗一遍，按照每個細胞培養瓶中加入400μl～500μl的比例加入裂解液，用槍吹打數下；

(3)加入RIPA細胞裂解液重懸沉淀后，置于冰上，以40%最大輸出功率，1次/10s超聲裂解細胞；

(4)冰上靜置30min后，4℃，12000rmp離心30min，收集上清液；用BCA比色法測定上清液中的蛋白質濃度；

③無血清細胞培養上清中目的蛋白的純化

(1)用0.45um的過濾器過濾無血清培養基的上清20ml；

(2)將過濾到的細胞培養上清和無血清培養基與木瓜蛋白酶0.5ml在4℃下攪拌24小時；

(3)填充柱的準備：5ml保留金屬針頭的注射器，并在底部塞上尼龍毛；

(4)平衡柱子：用5-10倍柱子體積的沖洗緩沖液洗滌柱子，估算尼龍毛所吸附的緩沖液的體積做為柱子體積；

(5)把(2)中的混合液上柱，過柱；

(6)用5-10倍柱體積的沖洗緩沖液過柱；

(7)用洗脫緩沖液以每小時50倍柱體積的流速洗脫產物；

(8)將洗脫下的樣品收集到中和緩沖液中分裝后置于-20℃中。