[發(fā)明專利]一種以香豆素為母核的半胱氨酸熒光探針及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410064348.7
• 申請(qǐng)日: 2014-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103773361A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙寶祥;苗俊英;戴溪;吳清華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/06
• 分類號(hào): C09K11/06;C07D311/16;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以香豆素為熒光母體的熒光探針，尤其涉及一種以2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯為母體的半胱氨酸熒光探針及其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)

香豆素具有較大的摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，是很重要的綠色熒光染料，經(jīng)過(guò)修飾后用于發(fā)光材料、化學(xué)傳感器以及標(biāo)記生物分子。近幾年利用熒光增強(qiáng)效應(yīng)檢測(cè)活體細(xì)胞中半胱氨酸的研究得到不斷發(fā)展。

半胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)的含量為30-200μM，是細(xì)胞中很重要的成分，是谷胱甘肽、輔酶A、氨基乙磺酸的前驅(qū)體，鐵硫磺族的硫化物的來(lái)源等。同時(shí)也具有很多重要的生物化學(xué)作用，例如生物催化、轉(zhuǎn)錄修飾、解毒等。半胱氨酸缺乏時(shí)會(huì)引起很多并發(fā)癥，兒童生長(zhǎng)緩慢、皮膚衰老、頭發(fā)褪色、肝損傷和水腫等。而半胱氨酸含量過(guò)高會(huì)引起風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森綜合癥，老年癡呆癥，不良妊娠反應(yīng)等。因此在生物和環(huán)境樣品中生物分子硫醇的檢測(cè)始終吸引著科學(xué)研究者的極大興趣。但檢索發(fā)現(xiàn)中國(guó)專利如【201110439870】、【201210586667】、【201210441256】中有報(bào)道可以選擇生物體中的活性硫醇，而專一性選擇半胱氨酸的專利卻很少。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種以香豆素為熒光團(tuán)的高選擇性和高靈敏度的半胱氨酸熒光探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的以香豆素為熒光團(tuán)的半胱氨酸熒光探針，其特征在于：所述熒光探針是2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I）所示：

上述2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯由如下方法制得：

2,4-二羥基苯甲醛與乙酰乙酸乙酯反應(yīng)得到3-乙酰基-7-羥基香豆素，然后與丙烯酰氯反應(yīng)得到2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯。

上述的熒光探針2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯作為半胱氨酸熒光探針在檢測(cè)PBS/乙醇緩沖液、牛血清或細(xì)胞中的半胱氨酸的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以與半胱氨酸發(fā)生邁克加成環(huán)化反應(yīng)，釋放出具有熒光的3-乙酰基-7-羥基香豆素，從而達(dá)到檢測(cè)的效果，見(jiàn)圖1。

配制2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇緩沖液（pH=7.4，v/v=2:3）的溶液，分別定量加入微升級(jí)的Cys,Hcy,GSH,arginine,aspartic?acid,glutamic?acid,glycine,histidine,lysine,proline,threonine,tryptophan,tyrosine,KNO₃,Ca(NO₃)₂,NaNO₃,Mg(NO₃)₂,Zn(NO₃)₂,Fe(NO₃)₃,H₂O₂和葡萄糖的水溶液。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度法和熒光分光光度法測(cè)試對(duì)不同氨基酸、人體常見(jiàn)金屬離子、雙氧水和葡萄糖的選擇性和響應(yīng)能力，結(jié)果見(jiàn)圖1-3。

在不加入NEM和加入NEM的活HeLa細(xì)胞中加入2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，對(duì)照細(xì)胞染色后熒光顯微成像變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

在不同濃度牛血清中加入1μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果見(jiàn)圖5。

本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以與半胱氨酸發(fā)生加成環(huán)化反應(yīng)，從而使溶液發(fā)出熒光，專一的選擇半胱氨酸，能夠區(qū)分半胱氨酸與還原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)半胱氨酸的微量高靈敏度檢測(cè)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1：為2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇緩沖液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常見(jiàn)金屬離子、雙氧水、葡萄糖和半胱氨酸的紫外吸收?qǐng)D譜。

圖2：為2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇緩沖液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常見(jiàn)金屬離子、雙氧水、葡萄糖和半胱氨酸的熒光發(fā)射圖譜。

圖3：為2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯與半胱氨酸加成環(huán)化產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜。

圖4：為2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯在HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。