[發明專利]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 201410062990.1
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103805588A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 李華
• 申請（專利權）人: 無錫華奇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/02
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

技術領域

本發明涉及蛋白酶化學修飾技術領域，尤其涉及一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法。

背景技術

超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase，簡稱SOD)，是一種廣泛存在于自然界動植物以及一些微生物體內的金屬酶，是生物抗氧化酶類的重要成員，它能夠清除生物氧化過程中產生的超氧陰離子自由基(O₂^-)，是生物體有效清除活性氧的重要酶類之一，被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線。它以超氧陰離子作為底物并催化其發生歧化反應，從而清除對機體有害的超氧自由基。其催化機理如下：

SOD（氧化型）+O₂^-——SOD^-（還原型）+O₂

SOD^-（還原型）+O₂^-——SOD（氧化型）+H₂O₂

總反應：2O₂^-+2H⁺SOD酶O₂+H₂O₂

當機體產生多余的超氧自由基且不能被及時清除時，就會引起機體疲勞，加速衰老同時誘發各種疾病。自由基學說認為：自由基具有高度的化學活性，是人體正常代謝的中間產物，可損害生物膜，是多種疾病產生、發展的根源。SOD作為機體內最重要的抗氧化酶體之一，可以直接清除過量的超氧自由基，阻止機體的過氧化，對機體有較高的防護作用及保健價值。由于超氧化物歧化酶的抗氧化作用，它已經被廣泛的應用于醫療、化妝品及其它化工領域。

由于SOD受到半衰期短、相對分子質量大、不易透過細胞膜、口服時易受胃蛋白酶分解、體內特異性等因素的限制，很難廣泛應用，因此必須對蛋白進行化學修飾。一般利用水溶性大分子如聚乙二醇、蔗糖、右旋糖肝和聚烯屬烴基氧化物等對SOD進行共價修飾。但是由于上述物質的分子量較大，修飾后的蛋白具有很強的免疫原性，雖然酶學穩定性得到了很大的提高，但是仍然很難被人體所利用。而月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)則克服上述的問題，月桂酸與SOD分子表面的氨基作用，月桂酸表面疏水基團的引入，增加了酶表面的疏水性，遮蓋了酶對熱、酸、堿、有機溶劑及蛋白水解酶敏感的易伸展位點，因而大大地加強了酶的穩定性。同時，小分子的月桂酸疏水基團的引入還能掩蓋酶分子的抗原決定簇，去除其免疫原性，更重要的是疏水基團對細胞膜和脂雙層具有高度的親和性，使大分子酶的透皮吸收有了理論基礎。

但是現有的月桂酸修飾超氧化物歧化酶的技術卻大都存在著回收率低、有害物質殘留和穩定性差等一系列問題，嚴重限制了月桂酸修飾超氧化物歧化酶的工業應用。

發明內容

本發明的目的就是解決現有技術中月桂酸修飾超氧化物歧化酶的技術回收率低、有害物質殘留和穩定性差等問題，提供一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法。

為實現該技術效果，本發明提供了如下的技術方案：

一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，該方法包括以下步驟：

（1）將100～200ml月桂酸、5～15g氯化亞砜和5～10ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至90～95℃，攪拌反應1～3小時，再回流1～3小時，

（2）回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146～150℃的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存，

（3）取150～250g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于15-20L弱堿性緩沖液中，在20℃下攪拌溶解，邊攪拌邊加入40～60ml活化的月桂酸，然后升溫至40℃，攪拌60min后，將溶液濃縮至2000～3000ml，然后迅速降溫至室溫，

（4）加入3倍體積量的-18℃的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于1500～2500ml的雙蒸餾水，再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物，取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液平衡好的層析柱層析1.5-2.5小時，最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。