[發明專利]一種檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410062487.6
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103792232A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 李忠;馬飛飛;顧玉龍;錢金蓉
• 申請（專利權）人: 南京博炫生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 沈振濤

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒及其應用。

背景技術

二肽基肽酶Ⅳ在真核生物中能夠介導T淋巴細胞和抗原遞呈細胞之間的信號通路，例如涉及2型糖尿病病理過程中的信號傳導過程，在免疫反應中具有重要生物學功能，目前更是成為免疫疾病治療研究的靶分子和疾病治療的診斷新指標；另外還廣泛存在于細菌各個種屬中，作為各種細菌致病性的毒力相關因子，為疾病預防和疫苗制備提供了新方向。隨著對二肽基肽酶Ⅳ研究的深入，其活性檢測方法也得到了不斷改善。在堿性條件下，應用Gly-Pro-pNA為酶作用底物，水解后生成游離的對硝基苯胺和Gly-Pro（甘氨酸-脯氨酸）二肽，利用對硝基苯胺的化學發光性，動態檢測405nm處吸光度即可測算出酶活性，此方法檢測簡易，但缺點是對硝基苯胺毒性為高毒物質，吸入或皮膚接觸對人體有害。Promega公司推出一種基于熒光發光團的檢測方法，靈敏度更高，速率更快，但檢測需要特殊的熒光檢測儀，且操作需要避免熒光的淬滅。

發明內容

發明目的：針對上述現有方案存在的問題和不足，本發明的第一個目的是提供了一種檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒。本發明第二個目的是提供了試劑盒的應用。

技術方案：為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：一種檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒,包括A液和B液，所述A液是將Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES緩沖液中制備而成，所述B液是將四氮唑鹽、PMS和NaCl溶解于PIPES緩沖液中制備而成。

其中，上述PIPES緩沖液濃度為1mol/L。

其中，上述A液中Gly-Pro-X多肽濃度為50mmol/L。

其中，上述B液中水溶性四氮唑鹽濃度為5mM，PMS濃度為0.2mM，NaCl濃度為0.15mM。

其中，上述水溶性四氮唑鹽為市售的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2h-四唑單鈉鹽。

其中，上述PMS為市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。

上述的檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒在檢測二肽基肽酶Ⅳ活性方面的應用。

本發明利用二肽基肽酶Ⅳ能夠切割肽段N端倒數第二位的脯氨酸的特性，當酶進行水解反應時，切割甘氨酸-脯氨酸-X（Gly-Pro-X）生成甘氨酸-脯氨酸（Gly-Pro）二肽，同時在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy?PMS）存在下，四氮唑鹽接受酶反應過程中的氫離子，還原成橙黃色水溶性甲贊（formazan），動態檢測450nm處吸光度測定二肽基肽酶Ⅳ的活性。一個酶活單位定義為在PH7.0，37℃條件下，每分鐘消耗一個微摩爾底物Gly-Pro-X所需的酶量。其原理反應方程式見圖1。

有益效果：與現有技術相比，本發明水溶性四唑鹽以其獨特的反應靈敏性和反應產物無毒性，將水溶性四氮唑鹽作為二肽基肽酶Ⅳ活性檢測的指示劑，既能達到高靈敏度的檢測范圍又對實驗者和環境無任何污染。

附圖說明

圖1為本發明原理反應圖；

圖2為本發明試劑盒應用檢測結果圖。

具體實施方式

通過下面的實施例可以更詳細的解釋本發明，公開本發明的目的旨在保護本發明范圍內的一切變化和改進，本發明并不局限于下面的實施例。

實施例1：檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒的制備

檢測二肽基肽酶Ⅳ活性的試劑盒,包括A液和B液，所述A液是將Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES緩沖液中制備而成，所述B液是將四氮唑鹽、PMS和NaCl溶解于PIPES緩沖液中制備而成。

1mol/L?PIPES緩沖液的配置：按配比稱取PIPES（哌嗪-N，N-雙（2-乙磺酸））自由酸，溶解于去離子水中，用NaOH調節PH至6.9，加去離子水定容至1mol/L，微孔濾器過濾除菌，4℃保存備用；

A液（酶反應底物溶液）的配置：將甘氨酸和脯氨酸的多肽Gly-Pro-X粉末（Gly-Pro-AMC艾美捷科技有限公司購買）溶解于1mol/L?PIPES緩沖液中，配成濃度為50mmol/L，微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存。

B液（水溶性四氮唑鹽指示液）的配置：按比例分別稱取水溶性四氮唑鹽、PMS、NaCl粉末溶解于1mol/LPIPES緩沖液中，混合均勻，微孔濾膜過濾除菌，-20℃避光保存。其中水溶性四氮唑鹽指示液（B液）包含5mM水溶性四唑鹽，0.2mM?PMS，0.15mM?NaCl。