[發(fā)明專利]一種簡易角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒及方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410062366.1 | 申請日： | 2014-02-22 |
| 公開（公告）號： | CN104862271A | 公開（公告）日： | 2015-08-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 馬蕾;程瀟;于花 | 申請（專利權(quán)）人： | 山西醫(yī)科大學(xué) |
| 主分類號： | C12N5/074 | 分類號： | C12N5/074 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 030001 *** | 國省代碼： | 山西;14 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 簡易 角膜 干細胞 分離 體外 培養(yǎng) 試劑盒 方法 | ||
1.一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒，其特征是所述試劑盒包括：組織清洗液、冷消化液、熱消化液和培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒，其特征是所述組織清洗液含有50-500IU/ml青霉素和50-500IU/ml鏈霉素，溶解在0.1%氟康唑注射液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒，其特征是所述冷消化液含有0.2-2.4U/ml?中性蛋白酶（Neutral?Protease）的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒，其特征是所述熱消化液是含有0.05-0.25%?胰蛋白酶（Trypsin）的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒，其特征是所述培養(yǎng)液含有2-10%?FBS，5-20ng/ml?EGF，1-10ug/ml?胰島素，0.1-2ug/ml?氫化可的松，溶解在基礎(chǔ)培養(yǎng)液，如KSFM中。
6.一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)方法，其特征是所述方法包括下述步驟：角膜緣組織提取，消化及體外培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)方法，其特征是所述角膜緣組織提取步驟包括：沿角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜和結(jié)膜下筋膜，劃痕深度0.1-3mm，環(huán)形切取角膜緣外0.2-2?mm、角膜緣和角膜緣內(nèi)0.2-3?mm的角膜上皮組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)方法，其特征是所述消化步驟包括冷消化和熱消化；所述冷消化包括：將所切取的板層角膜組織用清洗液漂洗后，置于中性消化液中，在1-8℃，低速搖動或震蕩1-5小時；所述熱消化包括：取出冷消化后的角膜板層組織，刮剝上皮層，棄去結(jié)締組織，加入蛋白酶消化液，30-40℃溫育2-15分鐘；加入培養(yǎng)液終止消化，用移液槍反復(fù)吸打使細胞分散，吸取細胞懸液并轉(zhuǎn)移到凍存管或培養(yǎng)皿。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種簡易原代角膜緣干細胞分離和體外培養(yǎng)方法，其特征是所述體外培養(yǎng)步驟包括：用培養(yǎng)液調(diào)細胞密度至1×104/ml-10X104/ml，接種至培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO2?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24-72小時后換液，此后，隔日換液。
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