[發明專利]一種阿魏酸脫羧酶晶體結構及其解析方法

有效

• 申請號: 201410062028.8
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103865912A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 余曉丹
• 申請（專利權）人: 無錫新和源發酵技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種阿魏酸脫羧酶晶體結構及其解析方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

現今，每年大約有10%的化石燃料被用于生產諸如塑料，橡膠和樹脂等材料。由于大約70年前塑料的發明，使這些“萬能的”材料已經被用于現代生活的各個方面。然而，由于化石燃料的不可再生性以及人們對二氧化碳積累所帶來的環境問題關注度的提高，尋找能夠替代諸如石油，天然氣和煤炭等化石燃料的可再生能源變得越來越重要。本領域的研究直接關系著經濟競爭力和國家安全。發展制備這些聚合物的新技術是目前世界學術研究和工業應用的當務之急。

苯乙烯是多聚物生產中產量最大和最重要的石油化學品和多聚物單體之一。現在，每年苯乙烯的產量在三千萬噸以上。苯乙烯單體可以轉化成聚苯乙烯（PS），苯乙烯-丁二烯橡膠（SBR），丙烯腈丁二烯苯乙烯塑料（ABS），苯乙烯-丙烯腈樹脂（SAN）。另外，苯乙烯還被廣泛地用于油漆，燃料和合成藥劑復合物。據估計，大約有1.3%的石油和天然氣被直接或間接用于生產苯乙烯和苯乙烯衍生物。目前，農產品，尤其是農產品的副產物是最廣泛的可再生生物材料的來源。因此，利用農產品副產物生產苯乙烯以及一個有效的生物合成方法具有重要的經濟價值。

現有技術將過量表達苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL，來自擬南芥）和FDC（來自釀酒酵母）基因導入過量生產L-苯丙氨酸的大腸桿菌宿主菌，從而實現苯乙烯的生產。阿魏酸脫羧酶可以催化反式肉桂酸生成苯乙烯。

酶的晶體結構通常被用于解釋酶的催化機理以及酶活性與催化位點的關系。目前為止，只有報道了一種來自腸桿菌屬（Enterobacter?sp.）的FDC晶體結構(Gu?et?al.,“Structural?basis?of?enzymatic?activity?for?the?ferulic?acid?decarboxylase(FADase)from?Enterobacter?sp.Px6-4,”PLoSOne,2011,6:e16262).)。然而，Enterobacter?sp.Px6-4FDC的氨基酸序列（168個氨基酸殘基）與酵母FDC（503個氨基酸殘基）只有19.0%的同源性，并且序列較短。因此，來自腸桿菌屬的FDC的結構與來自于酵母的FDC不具有可比性，并且不能用于鑒定酵母來源FDC的底物連接殘基。

因此，為了研究苯乙烯的生物合成，FDC晶體結構的獲取是不可或缺的。

發明內容

本發明提供了一種阿魏酸脫羧酶的晶體結構，采用技術方案如下：

所述阿魏酸脫羧酶晶體結構由8個不對稱單體組成，分別為：單體A（1）、單體B（2）、單體C（3）、單體D（4）、單體E（5）、單體F（6）、單體G（7）和單體H（8）；含有一個3-羥基肉桂酸配體；

晶體結構參數為：

空間群C121；

晶胞參數

所述阿魏酸脫羧酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述阿魏酸脫羧酶晶體結構由8個不對稱單體組成，分別為：單體A（1）、單體B（2）、單體C（3）、單體D（4）、單體E（5）、單體F（6）、單體G（7）和單體H（8）；含有一個3-羥基肉桂酸配體；

晶體結構參數為：

空間群C121；

晶胞參數

所述阿魏酸脫羧酶分子量為112KDa。

所述阿魏酸脫羧酶晶體結構中單體A（1）和單體H（8）組成二聚體、單體B（2）與單體F（6）組成二聚體、單體C（3）和單體E（5）組成二聚體、單體D（4）與其非對稱伴侶組成二聚體、單體G（7）與其不對稱伴侶組成二聚體。

所述阿魏酸脫羧酶晶體結構中，單體B（2）和單體F（6）組成的二聚體是通過兩個α-螺旋中的氨基酸殘基的相互作用來維持，通過鹽橋和疏水相互作用調節結構。

所述單體的多肽鏈折疊成一個三結構域結構，N端部分的結構是由兩個結構域構成，C端是由一個側面的α-螺旋結構組成；N端結構是由四個繩狀結構，三個螺旋和一個310-螺旋組成，中間結構域主要由β-結構元素構成，包含7個β-折疊，8個反平行β-折疊，C端結構域與中間結構域相連，其核心包含5個β-折疊及兩側面的兩個α-螺旋構成。

所述晶體的空間群C121的參數為：本發明還提供了一種阿魏酸脫羧酶晶體結構的解析方法，是通過冷凍液氮從培養液中結晶出單一晶體，利用X射線源獲取的晶體數據。