[發明專利]優化的豬圓環病毒ORF2截短基因

有效

• 申請號: 201410061725.1
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103834670A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 呂暾;陳靈艷;陳晟生;林拱陽;喬春曉;俞建萍;包松英
• 申請（專利權）人: 福州大北農生物技術有限公司;福州大學
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/75;C12R1/93;C12R1/125
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明屬于屬于生物技術領域，特別涉及優化的豬圓環病毒ORF2截短基因。

背景技術

豬圓環病毒(PCV)是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價閉合、單股環狀DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原。根據PCV的致病性及全基因組序列，可分為兩個血清型：PCV1與PCV2。PCV2含有兩個主要開放閱讀框ORF1和ORF2。其中ORF2為702bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結構蛋白，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗的首選基因。

PVC2的ORF2基因編碼Cap蛋白，為病毒的外殼蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市場上已經有以Cap蛋白為主要成份的疫苗產品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆蟲細胞表達系統生產。還未見微生物發酵生產的疫苗產品。

大腸桿菌是得到廣泛應用的蛋白生產菌種。ORF2外殼蛋白在大腸桿菌中的表達已經有不少研究報道。比如，孫繼國2009，查振林2005，周倫江2008，陳德坤2010，zhang?Gaiping2012。但所有上述報道均未能表達ORF2的全長基因序列，而是去除信號肽NLS的截短序列。目前認為，其原因是ORF2外殼蛋白在N端的一段NLS序列，含有大腸的稀有密碼子。

在研究人員的努力下，已有少數研究組成功的在大腸桿菌中成功的表達了ORF2基因。Celer2007報道，成功的在大腸桿菌的特殊菌種BL21-CODON-PLUS中表達了ORF2全長基因序列。其成功在于運用了特殊的菌種，這種菌種被插入了多個野生型大腸桿菌不具備的稀有密碼子基因。另一個技術路徑是通過改變原ORF2基因的密碼子使用方法，得到優化的適于在大腸桿菌中表達的基因。Bumba2009首先報道了一個優化的序列(Genbank?EU376523)，使得ORF2蛋白在大腸桿菌BL21中獲得了10mg/L的表達量。Huang2012等人又報道了一個優化的序列(Genbank?AY885225)，同樣獲得了全長蛋白的成功表達。這兩個序列是目前已知的兩個優化的ORF2-NLS序列。

枯草芽孢桿菌作為很有吸引力的外源基因表達的宿主，是目前原核表達系統中表達和分泌外源蛋白較理想的宿主。國內外在開發和使用枯草芽孢桿菌作為克隆和表達系統方面做了許多研究，但是到目前為止尚未有枯草芽孢桿菌表達PCV2-ORF2基因序列的的報道。

發明內容

為了解決現有技術中的不足，本發明的目的為提供能夠在枯草芽孢桿菌中成功得到表達的優化的豬圓環病毒ORF2截短基因。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

優化的豬圓環病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

所述基因在枯草芽孢桿菌中表達。

所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。

本發明采用以上技術方案，通過將去除NLS片段并根據密碼子偏好性優化后的截短基因，能夠成功的在枯草芽孢桿菌中得到表達。

附圖說明

下面將結合附圖說明和具體實施方式對本發明做進一步詳細的說明。

圖1為本發明優化的豬圓環病毒ORF2截短基因的表達載體質粒PHT43-ORF2雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜（1.PHT43-ORF2經雙酶切的電泳條帶；2.PHT43-ORF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA?Ladder?Marker）；

圖2為本發明優化的豬圓環病毒ORF2截短基因的表達質粒PHT43-ORF2成功轉化枯草芽孢桿菌168后，提取表達菌株中質粒經BamH1和Sma1雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜（1.BS168/PHT43-ORF2經雙酶切的電泳條帶；2.BS168/PHT43-ORF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA?Ladder?Marker）；

圖3為本發明優化的豬圓環病毒ORF2截短基因的表達質粒PHT43-ORF2成功轉化枯草芽孢桿菌WB800后，提取表達菌株中質粒經BamH1和Sma1雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜（1.WB800/PHT43-ORF2經雙酶切的電泳條帶；2.WB800/PHT43-ORF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA?Ladder?Marker）；