[發明專利]一種肽-晚期糖基化終末產物的檢測方法

有效

• 申請號: 201410060941.4
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103884787A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 李琳;梁志理;李冰;蘇健裕;徐振波;卞華偉;李玉婷
• 申請（專利權）人: 華南理工大學;中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/08
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

1.一種肽-晚期糖基化終末產物的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）液體樣品中二羰基化合物的消除；

（2）通過固相萃取技術對樣品進行除雜和肽‐晚期糖基化終末產物的富集，具體步驟：選取官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，分別使用甲醇和水活化萃取柱，上樣，用水淋洗去除雜質，用純甲醇將肽‐晚期糖基化終末產物洗脫出來；氮吹復溶，最后過膜；

（3）利用高分辨質譜對富集后的肽‐晚期糖基化終末產物定性；

（4）利用肽酶對富集后的肽‐晚期糖基化終末產物進行酶解，過膜除去肽酶，得到游離態的晚期糖基化終末產物；

（5）通過質譜分析對游離態的晚期糖基化終末產物進行定量分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽-晚期糖基化終末產物為：

含有賴氨酸殘基的肽-AGEs，

含有精氨酸殘基的肽-AGEs，

交聯在兩個賴氨酸殘基之間的肽-AGEs，

交聯在兩個精氨酸殘基之間的肽-AGEs，或

交聯在一個賴氨酸殘基與一個精氨酸殘基之間的肽-AGEs。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述肽-晚期糖基化終末產物為肽-羧甲基賴氨酸或肽-吡咯素。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述二羰基化合物的消除是在液體樣品中加入鄰苯二胺，其中鄰苯二胺加入的摩爾量大于樣品中還原糖或醛類的摩爾量。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述鄰苯二胺的摩爾量為樣品中還原糖或醛類的摩爾量的2-5倍。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽酶為羧肽酶A，其中羧肽酶A的加入量按照0.1-2.0EC?unit/0.05μmol底物的標準加入，水解條件為30-40℃下水浴2-5h。

7.根據權利要求1～6任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述晚期糖基化終末產物定性采用高分辨質譜分析，其中高分辨質譜采用液相系統為Agilent1290液相系統，UPLC檢測條件為：

色譜柱：Agilent?ZORBAX?SB-C18Column2.1×150mm

柱溫：30℃

流動相：水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=95：50-0.8min

水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=60：408min

水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=95：510-12min

流速：0.2mL/min

進樣量：10μL。

8.根據權利要求1～6任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（5）所述對游離態的晚期糖基化終末產物定量采用普通質譜分析，其中質譜采用液相系統為Waters1525機型，檢測條件為：

色譜柱：Waters?Symmetry?C18分析柱250mm×4.6mm

柱溫：25℃

流動相：水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=85：15

流速：0.5mL/min

進樣量：10μL。