[發(fā)明專利]一種重組人胸腺肽α1的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410060711.8
• 申請日: 2014-02-24
• 公開（公告）號: CN103789321A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇顯英;趙洪禮;王艷;林海;梁志敏;陳錚
• 申請（專利權(quán)）人: 東北制藥集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/70;C07K14/575;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 沈陽世紀(jì)藍(lán)海專利事務(wù)所(普通合伙) 21232
• 代理人: 譚琦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域中的一種重組人胸腺肽α1的制備方法。

背景技術(shù)

胸腺肽α1（Thymosinα1，Tα1），2010年進(jìn)入中國藥典后改名為胸腺法新。Tα1是一種酸性多肽，含有28個氨基酸，pI為4.2，相對分子量為3066kD（N端乙酰化的為3108kD），不含甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸，無二硫鍵及糖基化，唯一的修飾是N端乙酰化，氨基酸序列如下：

N—Ser—Asp—Ala—Ala—Val—Asp—Thr—Ser—Ser—Glu—Ile—Thr—Thr—

Lys—Asp—Leu—Lys—Glu—?Lys—Lys～Glu—Val—Val—Glu—Glu—Ala—Glu

—Asn—C。在Tα1的一級結(jié)構(gòu)中存在丙一丙、絲一絲、蘇一蘇、賴一賴、纈一纈、谷一谷等?6處氨基酸重復(fù)序列，約占總量的一半，這在其他活性多肽中未曾見過。在水中Tα1無特殊的構(gòu)型；在雙十四烷基磷脂酰膽堿與二羥甲基丙酸(10：1)的單層囊泡、十二烷基硫酸鈉溶液內(nèi)或鋅離子出現(xiàn)時，Tα1呈現(xiàn)部分空間構(gòu)型；在疏水性較強(qiáng)的三氟乙醇中Tα1出現(xiàn)?2個區(qū)域特征，即?β轉(zhuǎn)角和α螺旋，轉(zhuǎn)角位于第5和?8個殘基之間，α螺旋構(gòu)型位于第?17和?24殘基之間。隨環(huán)境而發(fā)生的構(gòu)型變化是胸腺肽α1與淋巴細(xì)胞相互作用所必需的，與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及淋巴細(xì)胞激活機(jī)制有關(guān)。

Tα1是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，主要是T淋巴系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑。Tα1可以恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的功能并促進(jìn)成熟T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞在病原組織周圍的聚集，促進(jìn)淋巴因子及淋巴因子受體的產(chǎn)生。在臨床上經(jīng)常將Tα1作為免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑用于各種免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治療，已應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥等疾病。

天然的Tα1其N端被乙酰化。有文獻(xiàn)報道，去乙酰化的Tα1同樣具有生物學(xué)活性。Tα1最早是Goldstin等從牛胸腺組織提取的胸腺素組份5（TF5）中分離出來的，現(xiàn)已用固相多肽合成技術(shù)成功合成，目前臨床所用的Tα1制劑為化學(xué)合成制劑，而使用化學(xué)合成方法生產(chǎn)的N端乙酰化的Tα1，不僅成本高，價格昂貴，且制備要求條件高，污染環(huán)境等。

利用基因工程技術(shù)制備重組Tα1是解決上述問題的最佳途徑。但是由于Tα1分子量較小，給制備重組Tα1帶來一定的技術(shù)困難。如表達(dá)單體Tα1時，由于其分子量只有3.0kD，使其在下游的分離純化過程中難度很大；亦有報道將Tα1_n（n為2-8）基因串聯(lián)起來，表達(dá)n個串聯(lián)的Tα1，后續(xù)采用裂解技術(shù)將其分為單體Tα1，如羥胺裂解、胰蛋白酶降解方法。由于胰蛋白酶降解方法不但成本高，而且特異性低，所以不適合工業(yè)化生產(chǎn)；羥胺裂解法由于條件劇烈，鹽濃度要求高，導(dǎo)致蛋白溶解量很低，僅為0.02mg/ml，為后續(xù)的規(guī)模化生產(chǎn)帶來困難。本發(fā)明提供的羥胺蛋白裂解方法可將蛋白溶解濃度提高到10mg/ml，大大提高了裂解效率和重組Tα1單體的產(chǎn)量。因此，研究開發(fā)一種重組人胸腺肽α1的制備方法是目前亟待解決的新課題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種重組人胸腺肽α1的制備方法，該方法采用基因工程技術(shù)制備重組胸腺肽α1，以克服化學(xué)合成成本高且污染環(huán)境等缺點，解決了串聯(lián)Tα1下游裂解濃度低的問題，不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求不限量的生產(chǎn)，具有投入少，產(chǎn)出高，利潤空間大，作用機(jī)理獨特，效果明顯，無或低毒副作用。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種重組人胸腺肽α1的制備方法，所述方法包括步驟如下，

（1）人工合成胸腺肽α1四串體的全基因序列，具體設(shè)計為：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、羥胺切割位點天冬酰胺-甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在每兩個天然胸腺肽α1序列之間加上甘氨酸對應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上終止密碼子、核酸限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對應(yīng)的核苷酸；

（2）采用雙酶切方法將胸腺肽α1四串體基因克隆至pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-2-4Tα1，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)；

（3）重組胸腺肽α1的制備與純化，具體方法是：重組胸腺肽α1四串體包涵體的溶解；重組胸腺肽α1四串體的純化；重組胸腺肽α1四串體的裂解；重組胸腺肽α1單體的純化；