[發明專利]采用雙核法檢測卷煙主流煙氣總粒相物遺傳毒性的方法

有效

• 申請號: 201410059881.4
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103792218A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 毛健;盧斌斌;李鵬;孫世豪;劉俊輝;謝劍平;張建勛;宗永立
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明涉及煙草及卷煙煙氣安全性評價技術領域，具體是一種采用雙核法檢測卷煙主流煙氣總粒相物遺傳毒性的方法，是通過測定卷煙煙氣總粒相物引起的細胞微核率來進行的，用于評價卷煙煙氣的遺傳毒性。

背景技術

卷煙煙氣中有69種化合物已經確定為致癌物，另外還有一部分物質是腫瘤促進因子或輔助致癌物，因此有關卷煙煙氣的毒理學評估成為吸煙與健康領域的熱點問題之一。有關遺傳毒性的體外毒理學測試常用來評價煙氣氣溶膠的致突變潛力。微核試驗是化學物質或混合物的遺傳毒性測試中常用的一種評價方法，卷煙煙氣和煙氣冷凝物均可以導致細胞微核的出現。比如，將BALB/c-3T3細胞或V79細胞暴露于主流煙氣和煙氣冷凝物中均可發現微核率的明顯增加[參考文獻1：Gu?Z?W,?Whong?W?Z,?Wallace?W?E,?et?al.?Induction?of?micronuclei?in?BALB/c-3T3?cells?by?selected?chemicals?and?complex?mixtures[J].Mutation?Research,1992,279:217-222.?參考文獻2：Channarayappa，?Nath?J，?Ong?T.?Clastogenic?and?aneuploidogeniceffects?of?cigarette?smoke?condensate,?Mitomycin?C?and?vincristine?sulfate[J].Mutagenesis,1992,7(6):457-260.?參考文獻3：Veltel?D,?Hoheneder?A.?Characterzation?of?cigarettesmoke-induced?micronuclei?in?vitro[J].Exp.Toxic?Pathol,1996,48:548-550.]。國際上，CORESTA體外毒理學特別工作組也推薦選用微核試驗方法來評價卷煙煙氣的遺傳毒性。基于此，國內的煙草科技人員通常采用中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）作為體外微核試驗的暴露體系來評價卷煙煙氣總粒相物的遺傳毒性，并且在實驗中分別設計了添加代謝活化體系和不添加代謝活化體系的處理過程（YQ?4煙草及煙草制品?煙氣安全性生物學評價?第3部分：體外微核試驗）。

發明內容

本發明的目的是針對目前一些采用哺乳動物細胞來測試卷煙煙氣總粒相物遺傳毒性的方法不夠簡便等特點，按照遺傳毒理學檢測應著重來源于人體組織細胞的原則，而專門開發的一種采用人支氣管上皮細胞系（BEAS-2B細胞）來進行卷煙煙氣遺傳毒性測試的方法，本方法省略了添加代謝活化體系的處理過程，可以較好的反映卷煙煙氣的體外遺傳毒性，操作簡單，靈敏度高，針對性強，結果可靠。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種采用雙核法檢測卷煙主流煙氣總粒相物遺傳毒性的方法，包括以下步驟：先在培養好的BEAS-2B細胞中加入卷煙煙氣總粒相物（TPM）的提取物樣品進行暴露，暴露過的細胞經培養和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液熒光染色，選擇分布均勻、染色較好的區域，在熒光顯微鏡下拍照計數，每個樣品計數1000個雙核細胞中含微核的細胞數量，與不加卷煙煙氣總粒相物暴露的對照樣品比較，判斷卷煙煙氣引起細胞微核增加的數量，進而判斷卷煙煙氣的遺傳毒性的大小；具體步驟如下：

a.?細胞培養及接種：將BEAS-2B細胞接種于細胞培養液中并置于CO₂培養箱孵育，當細胞生長達到70%-80%匯合時采用0.05%?胰酶溶液消化細胞并制備細胞懸浮液，將制備好的細胞懸浮液計數后接種至直徑35mm培養皿中，使每皿的細胞數量為1.5×10⁵-2.0×10⁵個，添加培養液至總體積為2mL，于CO₂培養箱中繼續培養24h；