[發明專利]一種海綿共生藍藻的分離培養方法

有效

• 申請號: 201410059248.5
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103849586A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 何山;駱其君;嚴小軍;張金榮;蔣瑩
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及藍藻的分離方法，尤其是涉及一種海綿共生藍藻的分離培養方法。

背景技術

海綿是底棲生物群落中的重要成員，廣泛分布于溫帶、亞熱帶、熱帶和極地地區，其豐度、多樣性及分布規律在不同地區呈現多樣化。海綿本身具有特定的功能，因而在海洋生態系統中有多種作用，還能提供大量新穎的生物活性物質。海綿所具有的獨特而重要的生態作用、豐富的生物多樣性、與微生物的共生關系等特征，能夠作為新天然產物的資源，從而成為海洋生物的研究熱點。例如專利公開號為CN1429203的發明專利“海綿動物抗腫瘤化合物”，就公開了分離自海綿動物的新抗腫瘤化合物。公開號為CN1336928的發明專利“由海綿分離的包括Asmarine?A和B的細胞毒性生物堿衍生物”，就公開了從海綿Raspailia物種分離了新型細胞毒性生物堿Asmarine?A和B，化合物的結構獲得了NMR、?X－射線的解析。類似的發明專利還有公開號為CN101519435的發明專利“?西沙海綿中一種環九肽類化合物及其用途”、公開號為CN101519436的發明專利“?西沙海綿中一種環八肽類化合物及其用途”、公開號為CN101519437的發明專利“?西沙海綿中一種環七肽類化合物及其用途”、公開號為CN101519438的發明專利“?西沙海綿中一種環肽類化合物及其用途”等。

藍藻是一類能夠進行光能自養的原核生物，有單細胞藍藻和多細胞絲狀藍藻等類型。不同的藍藻具有多系起源的特點，在系統發育樹上的多種地位，奠定了藍藻具有獨特的生物多樣性、生態環境適應性的基礎。藍藻作為海洋和陸地水體中初級生產力最重要的生產者，廣泛分布于地球上各類生境中。海洋藍藻在個體與分子水平上，具有在多個營養級影響海洋食物鏈動力學的有機物的多重效果。海洋藍藻能夠產生多種活性物質，具有不同的功能。許多甲殼動物對肝毒素(節球藻毒素)有抗性并能夠少量食用，表明了藍藻可能補充了食草類動物的食物；浮游動物食用藍藻，肝毒素降低，在如此錯綜復雜的生態鏈中，藍藻成為不可或缺的一環。

大量研究顯示多種微生物能寄生在海綿體內，在微生物與其寄主海綿之間可能存在互惠等共生關系，這樣的共生關系可能和多類生物活性物質的形成相關。中國發明專利名稱為海綿共生微生物混合培養及可培養種群監測方法（公開號為CN1766081），公開了海綿共生微生物種群中的細菌種類的體外分離與培養。但是，目前國內外還沒有公開任何關于通過快速分離的方法，獲取海綿共生藍藻，進而開展單種培養或純培養的相關研究報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能快速、大量分離共生藍藻，并且培養效果好、操作方便的海綿共生藍藻的分離培養方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種海綿共生藍藻的分離培養方法，具體包括以下步驟：

（1）海綿樣品的篩選：從海洋中篩選顏色帶有藍綠或黃色的完整海綿樣品；

（2）海綿樣品的預處理：將篩選的海綿樣品，浸泡在煮沸冷卻后的消毒海水中，然后清除雜物并進行清洗，再將海綿樣品切成0.5-1.5cm³大小的海綿塊，將海綿塊置于培養瓶中，同時將含有卡那霉素或新霉素的消毒海水加入到培養瓶中直至海綿塊下半部分浸沒在水中，上半部分露出水面，然后將培養瓶置于二氧化碳體積分數為0.035-0.065%的環境中，于25-32℃的高溫脅迫條件下，采用150-250μmol/(m²·s)的光照強度，預處理24-48h；海綿塊經預處理使其生長處于抑制狀態，一般的微藻，如硅藻甲藻等，一旦脫離水就會迅速脫水而不能存活，而藍藻具有一定的抗脫水功能，因此通過露出水面，實現微藻的分離；

（3）海綿樣品選擇：將預處理后的海綿塊切成0.25-0.75cm³大小的海綿塊，選取顏色較預處理前進一步加深的海綿塊；

（4）海綿搗碎：將步驟（3）選取的海綿塊置于食品粉碎機中，按1200-1500轉/分的轉速，搗碎2-4次，每次10-20秒；

（5）藍藻培養：將步驟（4）搗碎后的海綿塊與消毒海水按體積比1：3的比例混合后置于細胞培養板中，將細胞培養板置于培養箱中，于光照強度20-50μmol/(m²·s)，光照周期12/12小時，環境溫度20-25℃的條件下培養10～15天，直至在細胞培養板中長出藍藻藻落，挑取藍藻藻落置于消毒海水中；顯微鏡鏡檢如圖1所示，說明已成功挑出了藍藻藻落，藍藻生長情況良好；