[發(fā)明專利]一種熒光標(biāo)記多重PCR艱難梭菌檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410059155.2
• 申請日: 2014-02-21
• 公開（公告）號: CN103911430A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛斌文;葛海鵬;盧青;周麗萍;鄭衛(wèi)國
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌;曹翠珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包括，用于檢測艱難梭菌（Clostridium?difficile）菌株或有毒艱難梭菌菌株的試劑盒，及檢測鑒定樣品中的艱難梭菌有無及毒素分型的方法。

背景技術(shù)

艱難梭菌（Clostridium?difficile）為革蘭陽性產(chǎn)芽孢厭氧桿菌。艱難梭菌本身沒有侵襲性，部分產(chǎn)毒細(xì)菌通過分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至致死性假膜性腸炎，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium?difficile?infection,CDI）。醫(yī)院獲得感染性腹瀉所明確的病原中，以艱難梭菌最為常見；在抗生素相關(guān)性腹瀉病因中，艱難梭菌亦占20%～30%；而假膜性腸炎則幾乎100%由艱難梭菌所致。在美國，艱難梭菌感染是引起醫(yī)院感染性腹瀉的第一位原因。

盡管長期以來一直將這種微生物當(dāng)作一種能引起嚴(yán)重后果的不常見感染的病原菌，但最近幾年，艱難梭菌感染的特征已發(fā)生了變化。過去五年來，有很多關(guān)于艱難梭菌導(dǎo)致的疾病發(fā)生率、疾病的嚴(yán)重程度以及致死率等增加的報(bào)道。這種流行病學(xué)的改變與出現(xiàn)了一種新的高毒力的艱難梭菌菌株有關(guān)，這種菌株被稱為艱難梭菌NAP1（North?American?pulsed-field?type1）、PCR核糖型027（polymerase?chain?reaction?ribotype027）流行菌株，該菌株擁有以前常見艱難梭菌所沒有的一些特征，如毒素TcdA和TcdB的產(chǎn)生量增加，攜帶產(chǎn)生第三種毒素，又叫二元毒素（binary?toxin）的基因，并出現(xiàn)tcd?C基因中18個(gè)堿基對缺失。對喹諾酮類抗生素的耐藥性增加。由于NAPI／027菌株毒素A、B的產(chǎn)量分別較普通菌株高16倍及23倍，因此引起嚴(yán)重的艱難梭菌相關(guān)性疾病。

艱難梭菌檢測有直接糞便毒素測定包括細(xì)胞毒素測定（CTA）、酶免疫測定以及。CTA中毒素B的檢測被認(rèn)為是艱難梭菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但該試驗(yàn)需要48～72h，并且實(shí)驗(yàn)條件要求較高，其結(jié)果的可靠性在不同的實(shí)驗(yàn)室之間變化也很大。

熒光定量檢測的方法檢測因其快速、靈敏逐漸成為艱難梭菌檢測的主流檢測技術(shù)。初步統(tǒng)計(jì)，美國食品和藥物管理局（Food?and?Drug?Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證的定量檢測產(chǎn)品有BD公司的Gene-Ohm檢測系統(tǒng)，Gen-Probe公司的proGastro檢測系統(tǒng)，Cepheid公司的Xpert檢測系統(tǒng)，Great?Basin公司的Portrait檢測系統(tǒng)，F(xiàn)ocus?DX公司的Simplexa檢測系統(tǒng)。這些檢測系統(tǒng)除Xpert都只檢測艱難梭菌毒素B（tcd?B）基因。并且Cepheid公司的Xpert檢測系統(tǒng)同時(shí)檢測毒素B（tcdB）,tcdC基因缺失（tcd?C?deletion），二元毒素（Binary?Toxin）。

中國專利申請201310108285.6提供的方案在檢測單基因時(shí)靈敏度可以做到1個(gè)拷貝，但是沒有給出如何進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增的技術(shù)啟示。

中國專利申請201310316848.0提供的檢測系統(tǒng)可同時(shí)檢測四個(gè)基因座，艱難梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB），靈敏度最低為3pg/μl。可見復(fù)擴(kuò)的定量PCR靈敏度比單重檢測的要低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種可以同時(shí)檢測艱難梭菌菌種特異性的磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate?isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B（tcd?B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，需要其具有分型準(zhǔn)確、檢測限低的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)方案：

一種熒光標(biāo)記多重PCR艱難梭菌檢測試劑盒，包括有用于擴(kuò)增艱難梭菌的磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate-isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B基因（tcd?B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A基因（cdtA）和二元毒素B基因（cdtB）所對應(yīng)的引物。