[發明專利]一種制備耐鹽嫁接苗的方法

無效

• 申請號: 201410058433.2
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103757051A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李興林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01G1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種制備耐鹽嫁接苗的方法，屬于農林生物技術領域。可以廣泛應用于農林、園藝等方面。

背景技術

我國擁有大量的鹽堿地有待開發。選育耐鹽堿植物新品種與改良土壤等是利用鹽堿地的主要手段。有些生物具有天然的抗鹽特性，它們擁有大量的耐鹽基因，通過轉基因手段可以獲得轉基因耐鹽新品種。但由于公眾對轉基因食品安全、轉基因植物花粉對環境的可能影響等擔憂，轉基因品種的推廣受到了一定的限制。僅利用轉基因耐鹽材料作為砧木，非轉基因材料作為接穗，從接穗上收獲農產品等，就可以避免人們對這方面的擔憂。

發明內容

通過功能基因組比對，克隆耐鹽相關基因；構建耐鹽基因的植物表達載體；選擇農藝性狀表現良好、適應性強、對接穗性狀有良好主要的物種做砧木種源；通過農桿菌介導或其他手段轉化該砧木種子；篩選與鑒定耐鹽砧木幼苗；培育非轉基因幼苗；耐鹽轉基因幼苗為砧木靠接、芽接或劈接非轉基因接穗；培育嫁接苗，獲得耐鹽轉基因種苗。

具體實施方式

1.通過功能基因組比對，克隆耐鹽基因。

甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)來自于耐鹽植物。該酶催化形成的小分子能改善細胞膜的耐鹽能力。依據GenBank提供的核苷酸序列，兩端引入各引入一個限制性內切酶識別學列，設計相關引物，從該耐鹽植物基因組中PCR基因BADH片段；鏈接、測序比對正確，獲得完整BADH基因。

2.構建耐鹽基因的植物表達載體。

采用植物表達載體pCAMBIA1301，在其多克隆位點引入：35S啟動子-BADH基因-Nos終止子外源DNA片段。T-DNA左右邊界內含潮霉素抗性基因的完整表達框。表達載體通過熱激法轉入LB4404根瘤農桿菌中。

3.選擇農藝性狀表現良好、適應性強、對接穗性狀有良好主要的物種做砧木種源。

購買了國內6個西瓜的主栽品種，在天津種植，觀察它們的耐鹽耐旱、抗病等性狀，結果見表1。由此表1科長，2號作為砧木種源較好。

表1六個西瓜品種的農藝性狀比較

4.通過農桿菌介導或其他手段轉化該砧木種子。

2號西瓜種子經1-2Gy⁶⁰Co輻照后，浸泡在含上述表達載體的根瘤農桿菌LB4404中15-60min；浸泡種子在室內室溫、自然光條件下萌發，定期噴灑含30-50mg/L潮霉素的滅菌水。

5.篩選與鑒定耐鹽砧木幼苗。

20天后從幼苗的根、葉片上采樣，一部分用于提取DNA，以BADH基因、Hyg(潮霉素抗性基因)的特異性引物進行PCR鑒定；一部分對報告基因GUS進行化學組織測定。統計陽性率，結果見表2。部分陽性植株移栽在玻璃溫室0.6％的鹽堿土中供嫁接使用。

表2輻照-根瘤農桿菌介導的西瓜幼苗轉化率