[發明專利]一種青霉素G酰化酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201410058390.8
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103834631A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 陳亮;陳振明;付玲燕;周碩;賴敦岳;任紅陽;陳治;李蘭杰
• 申請（專利權）人: 浙江普洛得邦制藥有限公司;杭州師范大學
• 主分類號: C12N9/84
• 分類號: C12N9/84;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P35/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于生物催化領域，尤其涉及一種青霉素G酰化酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術

目前越來越多的藥物或其中間體是通過一種生物酶催化合成的方式，而非化學合成。很明顯，酶催化相比于傳統的化學合成有極大的優勢：（1）生物反應中可更好地避免有毒的反應試劑或溶劑；（2）酶具有高效率、底物特異性等特點；（3）更好的避免副反應的發生。

酰化酶是一類催化酰胺水解成相應羧酸的水解酶，其來源十分廣泛且作用底物譜廣，可以廣泛作用于水解脂肪、芳香、雜環氨基酰胺類酰胺，但是酶活差別巨大。當底物為芳香、雜環類酰胺，尤其是存在鄰位取代基時，酰化酶的活力受到顯著干擾，這種干擾與空間位阻和電子效應有關。

立體選擇性酰化酶是一種重要的手性合成工具酶，在制備手性羧酸及其衍生物方面具有廣闊的應用前景，日益受到重視。近幾年來腈化合物的生物催化技術迅速發展，酰化酶結合腈水合酶能有效地水解腈化合物生產多種酰胺和羧酸，應用于醫藥農藥食品及飼料行業。研究發現，在腈水合酶/酰化酶的雙酶體系中，立體選擇性主要產生于酰胺水解這一步，尤其是對位為手性中心的底物，酰化酶具有很好的立體選擇性，這使得它在制備手性中間體及光學純的氨基酸方面具有巨大的潛力而日益受到工業界的重視。

青霉索G酰化酶屬于水解酶家族，作用于肽鍵以外的碳-氮鍵，特別是直鏈酰胺鍵，其系統的名字是青霉素水解酶，別名包括青霉素酰化酶，脂肪酶，β-內酰胺水解酶，氨芐青霉素酰化酶。青霉索G酰化酶不僅可以水解青霉素或頭孢菌素，分別生成β-內酰胺類抗生素工業中的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）和7-ACA（7-氨基頭孢烷酸），而且能夠催化酰基側鏈與β-內酰胺之間的縮合反應，合成諸如阿莫西林、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢丙烯等β-內酰胺類抗生素。

國內外對于生物催化合成β-內酰胺類抗生素的研究越來越多，其中一個關鍵問題是所用的酶往往不能完全滿足實際工業化生產的要求，酶的穩定性、活性、手性選擇性等欠佳，如本申請中涉及的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的青霉素G酰化酶，雖然其能夠催化縮合7-APRA與側鏈2-羥基乙基對羥基苯甘氨酸酯合成頭孢丙烯，但是酶活力較低，僅為1.5U/mg左右，因此，有必要對其進行改造，提高酶活力。在野生型酶的基礎上設計點突變的構建新的突變體酶是一種常用的改善酶特性的方法。構建突變體酶的方法主要可分為三種類：非理性突變，半理性突變，理性突變。

非理性突變：首先對基因隨機突變，獲得基因文庫后進行篩選出有利的突變體，其中，體外隨機突變的技術多種多樣，主要有易錯PCR技術（error-prone?PCR），DNA重排技術（DNA?rearrangement?method），基因家族重排技術（gene?family?rearrangement?method）等。這種方法工作程序簡單明了，可能會出現突變極好的突變體，但也可能不會。突變庫容量較大，篩選出有利突變體的概率較低。

半理性突變：組合活性位點測試（CASTing）就是其中的一種。基本要點是：通過同源建模或晶體結構確定酶底物口袋中側鏈朝向位點的氨基酸殘基，同時選擇可以與其相互作用的另一個殘基，構建飽和突變體庫，以達到減少突變庫容量的同時增加篩選出有益突變的概率。其構庫依據一般為選定底物口袋范圍內的所有氨基酸殘基，將側鏈朝向底物口袋的選出，根據其所在的位點的二級結構（ɑ螺旋為n+4，β折疊為n+2，loop為n+1）選定另一個氨基酸，針對這兩個氨基酸構建飽和突變進行篩選。這種策略構建的突變庫庫容量小，有效性高。

理性突變：在酶-底物三維建模和底物對接的基礎上，加以軟件分析，通過化學量子計算、熱能計算、分子動力學分析等，在酶活性中心區域選擇有效的點進行定向突變，直接獲得有益的突變體。這種方法突變庫的量極小，篩選出優突變的概率基本上達到100%。然而，前期的計算工作量極大，時間長需要知識的較多前期積累，現階段還無法達到通過先計算再進行定點定向突變的程序。

無論采用何種方法，只有使酶在適宜的突變位置發生特定方向的突變才有可能改善酶的催化特性。

發明內容

本發明提供了一種青霉素G酰化酶突變體，用于合成頭孢類抗生素，且酶催化活力提高。

一種青霉素G酰化酶突變體，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。