[發明專利]雙核酸標記的比率電化學免疫傳感器

在審

• 申請號: 201410058187.0
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103792372A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 鞠熀先;嚴楓;任克維;吳潔
• 申請（專利權）人: 南京大學;江蘇省腫瘤醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明為一種基于雙核酸標記的比率電化學免疫傳感器。用兩種分別標記電化學活性分子的核酸鏈構建雙電化學信號免疫傳感界面，其中1條鏈(捕獲探針)在電極上以Au-S鍵固定，另1條鏈標記抗體，并通過堿基互補配對與捕獲探針結合，在免疫反應誘導的鄰位效應作用下離開傳感器表面，使兩種電活性分子分別遠離和靠近電極表面，通過檢測兩種電活性分子的氧化電流之比，實現對目標蛋白質的簡單、快速、高靈敏測定。

二、背景技術

免疫分析作為一種高選擇性和高靈敏度的分析方法，在環境監測、臨床診斷、食品安全等領域得到了日益廣泛的應用。在實際應用中，要求發展簡單、快速、靈敏的免疫檢測方法。

根據免疫分析步驟的不同可分為異相免疫分析和均相免疫分析，后者因為能獲得更高的靈敏度且免清洗易于實現自動化而被廣泛應用于臨床檢測。與基于放射分析、熒光、化學發光、電化學發光、表面等離子共振等分析技術的免疫分析方法和傳統的酶聯免疫分析方法相比，電化學免疫分析具有儀器便宜、操作簡便、靈敏度高等獨特優點。各種電化學免疫傳感器，尤其是安培免疫傳感器得到廣泛的研究和應用。在傳統的電化學免疫方法中，大多使用異相免疫分析，需要多步清洗，耗時且樣品容易污染。基于鄰位效應發展的免疫分析方法近年來得到發展。在該方法中兩種核酸-抗體偶聯物與抗原(待測物)進行夾心免疫反應，使得在核酸-抗體偶聯物上的兩種不同核酸距離靠近，誘發鄰位效應；這兩種核酸的雜交或者連接產生新的檢測核酸，通過檢測產生的核酸，間接測定目標蛋白質的濃度。由于該方法可均相進行，具有簡單、靈敏度高、特異性好、樣品消耗少等優點。然而，該方法基本采用PCR技術來檢測產生的檢測核酸，步驟復雜，所需時間長。將電化學檢測與鄰位免疫分析方法結合起來，可以縮短檢測時間，降低分析成本。

傳統的電化學免疫分析方法都采用單信號檢測，檢測信號易受環境影響。本發明采用雙電化學信號之比進行電化學免疫分析，可提高檢測靈敏度和準確性，擴大線性范圍，簡化檢測步驟。

三、發明內容

本發明的內容是：用兩種電化學活性分子標記的核酸鏈構建比率電化學免疫傳感界面，通過免疫反應誘導鄰位效應，使1種電化學活性分子標記的核酸鏈離開電極表面，另1種電化學活性分子標記的核酸發生結構變化而使該電化學活性分子接近電極表面，導致它們的氧化信號減少或增加，通過兩種電化學活性分子的氧化電流之比進行比率電化學免疫傳感。

本發明通過以下技術方案來實現：

通過在金電極表面自組裝兩端分別標記巰基(SH)與二茂鐵(Fc)的捕獲探針DNA3，同時基于DNA3與DNA1間的互補雜交，使亞甲基藍(MB)標記的DNA1-抗體1固定于電極表面，形成比率電化學免疫傳感界面。在目標蛋白質存在時，DNA2-抗體2與DNA1-抗體1通過夾心免疫反應形成免疫復合物，并產生鄰位效應，該效應促使DNA2與DNA1雜交，導致MB標記的DNA1-抗體1脫離免疫傳感界面，同時，DNA3在金電極表面形成發夾結構，使Fc靠近電極表面。通過檢測MB和Fc的氧化電流，用Fc和MB氧化電流的比值進行目標蛋白質的濃度測定。

上述捕獲探針DNA3從3’端開始的1-4堿基與從5’端開始的1-4堿基完全互補，可形成發卡結構(圖2)。

上述DNA1與DNA3及DNA2分別有12及11個堿基完全互補(圖3，圖4)。

本檢測系統測定目標蛋白質的原理：

本發明設計的比率電化學免疫傳感器的檢測原理如圖1所示：將含有目標蛋白質的樣品溶液和DNA2-抗體2混合，并將微量混合液滴在比率電化學免疫傳感界面，在室溫條件下溫育40分鐘。溫育過程中，目標蛋白質與抗體1、抗體2進行夾心免疫反應，并產生鄰位效應，促使DNA2取代DNA3與DNA1雜交，導致電化學活性分子MB標記的DNA1-抗體1脫離免疫傳感界面，同時DNA3在金電極表面形成發夾結構，使電化學活性分子Fc靠近電極表面。溫育完成后，傳感器用沖洗液沖洗，然后插入檢測溶液，用交流伏安法檢測Fc和MB的氧化電流；Fc及MB的氧化電流與目標蛋白質的濃度分別成正及負相關。用Fc與MB氧化電流的比值對目標蛋白質濃度的對數作圖，獲得標準曲線，通過標準曲線測得待測溶液中目標蛋白質的濃度。

本發明與現有技術相比，具有以下特點：

本發明通過核酸鏈構建比率電化學免疫傳感界面，結合免疫反應誘導的鄰位效應、核酸的結構變化和電化學活性分子在電極表面的氧化電流相應，構建一種簡單、快速、高靈敏的比率電化學免疫傳感器。相對現有免疫分析方法，具有以下特點：