[發明專利]一種建立類風濕性關節炎動物模型的誘導劑及其制備與應用

有效

• 申請號: 201410057939.1
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN103830721A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 曾文;龔立;潘玲珍;申渝波
• 申請（專利權）人: 四川普萊美生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K39/39;A61K38/39;A61K9/107
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 錢成岑;詹永斌

技術領域

本發明屬于生物領域，涉及一種建立類風濕性關節炎動物模型的誘導劑及其制備與應用。

技術背景

類風濕關節炎(rheumatoid?arthritis,?RA)是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性自身免疫性疾病，我國的患病率為0.32%-0.36%，是造成勞動力喪失與殘疾的主要疾病之一。

RA是一種侵犯全身多個關節，病理學特征是關節內滑膜炎，早期為滑膜充血，滑膜疏松，慢性炎癥新生纖維血管組織大量增加，導致滑膜不規則增厚，絨毛肥厚突入關節腔內形成血管翳，進而侵蝕破壞關節骨皮質和軟骨組織，終致關節強直、畸形和功能喪失；病程呈慢性、進行性、侵襲性,不及時治療，病情進展迅速，并且關節畸形是一種不可逆性的損害。其發病機制十分復雜，迄今尚未完全闡明。

國內外對RA進行了大量的動物實驗研究，并形成了一些較為成熟的動物模型：

（1）佐劑性關節炎（AA）模型，該法屬于急性應激反應，缺乏慢性病理過程，病變具有一定的自限性。

（2）膠原性（CIA）關節炎模型，具有典型的關節炎體征，發病率比單獨使用弗氏完全佐劑注射顯著提高，且CIA模型臨床癥狀、病理學改變等類似RA。

（3）卵蛋白誘導的關節炎模型，該模型成功率雖高，但在免疫學指標及病程特點與RA具有一定差異。

（4）病癥結合模型，該模型尚不完善，癥候屬性評價困難，穩定性、可靠性差等問題，而不被臨床基礎研究采納。

綜上，CIA模型是研究和篩選治療RA藥物的理想模型，也是美國食品藥品監督管理局用于治療RA藥物篩選的動物模型。

II型膠原（CII）是目前較為公認的關節軟骨特異性抗原，與軟骨破壞相關的單核因子白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌異常，是骨關節發病的中心環節。

由于實驗條件的限制，以往研究CIA模型的動物實驗對象一般限于大鼠、小鼠等，而靈長類動物相對較少，但大鼠等動物畢竟與人類差別巨大。小動物模型不能很好模擬人RA的發病過程和病變程度，不能描述病情的加重和緩解。另外，現有的在構建CIA模型中使用的誘導劑由于免疫反應程度有限，且炎癥反應維持時間較短，尚不能很好的模擬類風濕性關節炎的臨床癥狀和病理學改變。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種全新的建立類風濕性關節炎動物模型的誘導劑。

本發明通過以下技術方案來實現：

一種建立類風濕性關節炎動物模型的誘導劑，所述誘導劑為混合乳劑，包括II型膠原、氫氧化鋁、冰乙酸和完全弗氏佐劑。其中II型膠原作為關節軟骨特異性抗原，可以誘導類風濕性關節炎相關癥狀；冰乙酸作為溶劑便于各組分形成均勻的混合乳劑；氫氧化鋁和完全弗氏佐劑相互協同，可顯著加強免疫反應，同時氫氧化鋁還可以使關節炎癥狀維持更長的時間，使動物模型的臨床癥狀和病理學改變更接近真實的類風濕性關節炎。

作為可選方式，在上述誘導劑中，所述Ⅱ型膠原為牛Ⅱ型膠原。牛Ⅱ型膠原容易獲得，且在以恒河猴作為模型動物構建動物模型時采用牛Ⅱ型膠原癥狀的相似程度更高。

作為可選方式，在上述誘導劑中，所述Ⅱ型膠原終濃度為2-4?mg/ml，氫氧化鋁終濃度為0.5-1.5?mg/ml。采用該濃度范圍既可以誘導產生足夠明顯的癥狀，又避免向模型動物體內引入大量的誘導劑，降低引入誘導劑時動物的痛苦，提高動物福利。

作為可選方式，在上述誘導劑中，所述Ⅱ型膠原終濃度為3?mg/ml，氫氧化鋁終濃度為1mg/ml。

本發明還提供了一種制備上述的誘導劑的方法，包括以下步驟：

1）冰乙酸溶液的配制：取冰乙酸，加入雙蒸水，稀釋成濃度為0.1mol/L的冰乙酸溶液；

2）膠原溶液的配制：將II型膠原加入到步驟1）制得的冰乙酸溶液中，吹打均勻后，4℃冰箱中保存8小時以上，制得II型膠原溶液；

3）膠原乳劑的配制：將步驟2）中制得的Ⅱ型膠原溶液滴加至同等體積完全弗氏佐劑（作為可選方式，所述完全弗氏佐劑的溫度控制在4-8℃）中，同時加入氫氧化鋁，快速攪拌使其充分乳化，?4℃冰箱保存備用。

作為可選方式，在上述誘導劑的制備方法中，所述步驟2）中II型膠原溶液的濃度為4-8?mg/ml。

本發明還提供了一種建立類風濕性關節炎動物模型的方法，包括以下步驟：

1）背部皮內致敏：選取健康的模型動物，沿其背部皮膚皮下注射本發明所述的誘導劑，每只模型動物中Ⅱ型膠原的注射劑量為1-2mg；

2）飼養和觀察40天；

3）獲得類風濕性關節炎陽性的動物模型。