[發明專利]一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法及定量檢測人血漿HCMV中和抗體試劑盒

有效

• 申請號: 201410056988.3
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103901209A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 王明麗;甘霖
• 申請（專利權）人: 王明麗;甘霖
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明涉及基因工程技術、診斷試劑和血液制品研發領域，特別是涉及一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法及定量檢測人血漿HCMV中和抗體試劑盒。?

背景技術

人巨細胞病毒(human?cytomegalovirus，HCMV)屬于人類皰疹病毒β亞科病毒，在人群中的感染極為普遍，呈世界性分布，血清流行病學調查表明，40～100%成人有HCMV抗體。目前的研究表明HCMV是人類先天性感染最常見的病原體之一，對孕婦及胎兒影響巨大，常造成流產、死胎、胎兒畸形、發育遲緩及遲發性中樞神經系統缺陷等疾病。?

孕婦在孕期（尤其是妊娠早期）因激素水平的急劇變化、心理和免疫水平等改變，使原發性感染機會增加，激活潛伏的HCMV、或感染新的HCMV毒株產生再發感染，病毒經胎盤傳給胎兒，引起胎兒先天性感染。先天性HCMV感染是引起出生缺陷最常見和最重要的病毒病因，主要表現為神經損傷如引起小腦畸形、室周鈣化、腦水腫、小眼畸形等。非遺傳性感音神經聽覺喪失（sensorineural?hearing?loss,SNHL）是先天性HCMV感染最常見的后遺癥表現。研究發現，發達國家先天性HCMV感染率比發展中國家低，如意大利為0.47%(CI:0.22–1.0%)；瑞典為0.46%(CI:0.37–0.58%)；而岡比亞則高達13.6%。在美國，每年約有40000新生兒發生先天性HCMV感染，其中10%～15%發生遲發性后遺癥，主要為SNHL、智力障礙、學習能力低下等神經系統損傷性疾病，其中因SNHL每年付出高達10億美元的醫療帳單。2011年，我國出生人口約1615萬，按照發達國家先天性HCMV感染率來計算，我國每年約有16.2萬例先天性HCMV感染，家庭和國家都將為此支出高昂的成本。根據目前的臨床資料顯示，實際上先天性HCMV感染的人數可能是16.2萬人/年的2～3倍。此外，HCMV感染也是器官移植失敗和艾滋病病人并發感染死亡的主要原因之一。?

鑒于HCMV對人類的巨大危害，人們一直在尋找更好的治療方法。最常用?的抗病毒藥物為更昔洛韋，但是由于長期使用目前已經出現了很多耐藥毒株，尤其是在移植患者和艾滋病患者中更為常見。具有高中和滴度的特異性HCMV?IgG已被證明具有良好的治療作用，而且不產生耐藥性。因此，篩選含高HCMV中和滴度的血漿，制備靜脈丙種球蛋白制劑，將有助于對HCMV感染的治療。HCMV雖然在人群中的感染率很高，HCMV特異性IgG的含量也不低，但是體外病毒中和實驗證明只有約5%的高滴度血漿才具中和病毒的能力。目前雖有部分用于檢測人血漿中HCMV?IgG滴度的ELISA試劑盒，但其結果與病毒中和實驗的結果不一致。因此，用這些試劑盒篩選的高滴度血漿并不能用于特異性靜脈丙種球蛋白制劑生產。這與ELISA試劑盒選用的包被抗原有關，HCMV感染機體主要由pp150蛋白誘導機體產生體液免疫，因此市售的ELISA試劑盒多采用pp150蛋白作為包被抗原，但針對pp150蛋白的抗原并不具有中和病毒的能力。IE1基因是HCMV的立即早期基因，控制病毒DNA的復制，它在病毒感染2h即開始表達，體外實驗顯示IE1的單克隆抗體可以阻斷HCMV感染易感細胞。鑒于此，我們選取了編碼IE1基因的部分序列基因(1006～1521nt)，采用基因重組技術，原核表達，親和層析后獲得一種融合IE1重組蛋白。經過改造過的IE1重組蛋白既保留了其抗原性，又提高原核表達量。采用該重組蛋白包被ELISA板，我們成功地用間接ELISA法，快速篩查出中和抗體含量更高的人血漿，其結果與中和實驗結果一致率大于96.0％?

發明內容

本發明目的就是為了彌補已有技術的缺陷，提供一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法及定量檢測人血漿HCMV中和抗體試劑盒。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法，包括以下步驟：?

（1）將IE1蛋白抗原用pH為9-10的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔板，100ng/孔，置濕盒中4℃，22-24小時，PBST洗板3次，每次2-4min，然后拍干；?

（2）每孔加入100μl含1%BSA和10%小牛血清的PBS，37℃孵育1h，洗板3次后密封，即得所述的重組蛋白IE1包被酶標反應板。?

一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法，所述的重組蛋白IE1的氨基酸殘基序列如SEQ?No.1所示。?

一種重組蛋白IE1包被酶標反應板的制備方法，所述的重組蛋白IE1的DNA核苷酸序列如SEQ?No.2所示。?