[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子功能蛋白設(shè)計(jì)、合成及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410056380.0
• 申請(qǐng)日: 2014-02-19
• 公開（公告）號(hào): CN104844696A
• 公開（公告）日: 2015-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 席建忠;孫常宏;王干誠(chéng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/00
• 分類號(hào): C07K14/00;C07K1/00;G01N33/68
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種“轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(TranscriptionActivator?Like?Effectors，TALE)”功能蛋白設(shè)計(jì)、合成以及上述功能蛋白的應(yīng)用，特別涉及上述功能蛋白。?

背景技術(shù)

在后基因組時(shí)代，我們迫切需要高效的基因操縱、合成等新型的生物工程技術(shù)。比如，我們常常需要抑制或沉默一個(gè)基因的表達(dá)。傳統(tǒng)的基因敲除(Gene?Knockout)技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率非常低，通常為10^-6級(jí)；RNAi技術(shù)雖然簡(jiǎn)單易行，但是又很難獲得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我們常常還需要針對(duì)特定基因，進(jìn)行某幾個(gè)堿基，甚至某一段序列的修改。同樣只依賴于同源重組技術(shù)，很難獲得理想的效果。?

TALE(Transcription?Activator?Like?Effectors)首先是植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)上發(fā)現(xiàn)的，特異性地結(jié)合到DNA，在該病原菌感染過(guò)程中對(duì)植物基因進(jìn)行調(diào)控。TALE蛋白可以穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA結(jié)合域結(jié)合，調(diào)控植物基因組中與疾病和抵抗力相關(guān)基因的表達(dá)。簡(jiǎn)單講，TALE是由4個(gè)或以上特異性識(shí)別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成，而每個(gè)“蛋白模塊”包含34個(gè)氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)，被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(repeat?variable?diresidue，或者RVDs)。TALE識(shí)別DNA的機(jī)制在于DNA靶點(diǎn)上的一個(gè)核苷酸被一個(gè)重復(fù)序列上的RVD識(shí)別。?

理論上，針對(duì)A、T、G、C任何一個(gè)堿基，都能找到與之特定結(jié)合的RVDs。因此，對(duì)任何一段DNA序列，我們可以方便的設(shè)計(jì)、合成出對(duì)應(yīng)蛋白模塊組成的TALE。需要指出的問(wèn)題是，1)雖然針對(duì)A、T、G、C都可以設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的RVD，但是，它們之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系還有待于進(jìn)一步優(yōu)化；2)設(shè)計(jì)合成的TALE能否高效地靶向結(jié)合基因組上的預(yù)期位置，還決定于很多其它因素；3)蛋白模塊的組成也有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。?

雖然TALE還有很多問(wèn)題有待于深入研究加以解決，但是這并不妨礙它的應(yīng)用。一個(gè)最大的應(yīng)用前景是TALEN。TALEN是一個(gè)融合蛋白，由與某段DNA序列特異性識(shí)別TALE與能在DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂(double?strand?break，DSB)的內(nèi)切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是異源二聚體分子(即兩單位的TALE-Nuclease共同作用)，能夠在兩個(gè)相隔較近的特異識(shí)別序列間切割DNA。?

TALEN產(chǎn)生的DSB能夠通過(guò)以下兩種途徑進(jìn)行修復(fù)：1)非同源末端連接(Non?Homologous?EndJoining，NHEJ)：NHEJ是以自然修復(fù)機(jī)制，能被用來(lái)引入核苷酸缺失以便失活或敲除一個(gè)特異性的靶基因；2)同源重組(Homologous?Recombination，HR)：DSB促進(jìn)同源重組，在一個(gè)DNA模版存在下，能夠產(chǎn)生特異性DNA序列改變，也能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因整合到DNA序列上。NHEJ途徑可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene?Editing)，或者基因敲入(Gene?Knock-in)。無(wú)論是哪種途徑，TALEN產(chǎn)生的修復(fù)與單純依賴于同源重組相比，基因發(fā)生重組的效率大大提高，這為我們從事基因組訂制化(genome?customization)提供方便的技術(shù)手段，為開發(fā)出更簡(jiǎn)易的新型基因組靶向修飾技術(shù)帶來(lái)了新希望。?

TALE另外一個(gè)大的應(yīng)用前景是TALEA(transcription?activator-like(TAL)effector?activator)。TALEA是一個(gè)融合蛋白，將識(shí)別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64Activation?Domain)融合，可構(gòu)建成識(shí)別啟動(dòng)子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA。該融合蛋白將結(jié)合基因啟動(dòng)子附近的特異DNA序列，并通過(guò)VP64激活區(qū)域與Polymerase?II結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了內(nèi)源目標(biāo)基因的表達(dá)。在實(shí)際操作中，需在目標(biāo)基因的啟動(dòng)子上游選取靶序列(一般12-18個(gè)堿基)，構(gòu)建TALE識(shí)別模塊。?

TALE技術(shù)已經(jīng)開始在生命科學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角。2011年，法國(guó)和美國(guó)兩個(gè)小組合作，利用TALEN技術(shù)，在大鼠中敲除失活I(lǐng)gM功能，效率高達(dá)60％。2011年，包括中國(guó)在內(nèi)的幾個(gè)小組，利用TALEN技術(shù)，在斑馬魚中，敲除失活hey2等基因，效率也達(dá)到了30％以上。?