[發明專利]1，3-二羥基丙酮高產菌株及其構建方法

在審

• 申請號: 201410056346.3
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103789250A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 許曉菁;何雨晴;夏博勛;趙瓊
• 申請（專利權）人: 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是1，3-二羥基丙酮高產菌株及其構建方法。

背景技術

目前，迅速升溫的生物柴油投資熱使生產過程中副產的甘油出現過剩，每生產10g生物柴油就會產生1g甘油，因此為這些甘油尋找新的利用途徑已引起全球的普遍關注，而利用甘油發酵生產1，3-二羥基丙酮則是其中的一條有效途徑。

1，3-二羥基丙酮（DHA）是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，且對人體和環境無毒害。DHA具有極強的防曬性，利用這一特性，國外已經成功開發出了多種保濕防曬化妝產品；在醫學上已經證明DHA可以用來治療白斑和白癜風，且具有抗肥胖功效，還可以直接作為一種抗病毒試劑，DHA的相應的衍生物還具有抗艾滋病病毒的作用；而且，DHA的衍生物也是有機合成化學中一類非常重要的中間體，其用途極其廣泛。

利用甘油發酵二羥基丙酮的過程中，優良的菌種是發酵成功的前提。相對于傳統的菌種選育方法，基因工程手段具有目標明確、途徑清晰的優點，經過基因改造的高產菌株將更適于工業化的生產過程，可降低生產成本，繼而實現經濟效益的大幅度提升。目前國內針對高產二羥基丙酮生產菌株的研究多集中于菌種選育，而利用基因工程手段選育DHA高產菌株的研究還很少，經查新發現，僅華東理工大學的魏東芝等人用重組基因工程質粒pET－gdh和pET－ndh轉化大腸桿菌，構建得到一株工程菌，提高了二羥基丙酮的轉化率。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供1，3-二羥基丙酮高產菌株。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供所述1，3-二羥基丙酮高產菌株的構建方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

1,3-二羥基丙酮高產菌株GOX205，是以氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter?oxydans)ATCC621H作為宿主，選擇質粒pBBR1MCS-2作為載體，通過將編碼甘油脫氫酶的sldAB基因轉化進入宿主并進行表達的一種菌株。

上述1，3-二羥基丙酮高產菌株的構建方法，具體步驟如下：

（1）制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體；

（2）擴增sldAB基因；

（3）pBBR1MCS-2質粒與sldAB基因的消化；

（4）DNA片段的純化回收；

（5）載體pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的連接；

（6）質粒的富集與提取；

（7）電轉化法構建重組菌株GOX205；

（8）挑選轉化子。

上述1，3-二羥基丙酮高產菌株的構建方法，具體步驟如下：

（1）制備氧化葡萄糖酸桿菌染色體：將氧化葡萄糖酸桿菌接種到含有5ml甘露醇液體培養基的試管中，30℃條件下振蕩培養10-12小時；然后將培養液轉移入1.5ml離心管中，12000rpm離心30-60秒后，棄上清液，沉淀用0.5ml無菌水重懸，然后12000rpm離心30-60秒，收集菌體；加190μl?TE懸浮沉淀，并加10μl10%SDS，1μl20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃保溫1h；加30μl5mol/LNaCl，混勻；加30μl?CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃保溫20min；加入300μl酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm離心10min，將上清液移至干凈離心管；加入300μl氯仿/異戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干凈管中；加300μl異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10min，沉淀DNA；5000rpm離心10min，沉淀DNA，加入500μl70%乙醇，5000rpm離心10min，棄乙醇，自然風干；溶解于20μlTE，于-20℃保存備用；

（2）擴增sldAB基因：以氧化葡萄糖酸桿菌染色體作為模板，根據氧化葡萄糖酸桿菌染色體中sldAB基因序列設計引物，上引物為sldab-fw：catggatccaacgccagtttgctctg，下引物為sldab-re：catgaattccacctccgaccgtcat分別在上下引物兩端添加HindⅢ、EcoRⅠ限制性內切酶酶切位點，以PCR方法擴增sldAB基因，PCR體系為50μl：上下引物均為1μl,200M的dNTP4μl,緩沖液5μl，步驟（1）所述氧化葡萄糖酸桿菌染色體模板為0.5μl，雙蒸水38.25μl，聚合酶0.25μl；PCR擴增條件為：94℃預變性4min；94℃變性30sec；55℃退火30sec，72℃延伸3min，得到PCR擴增產物sldAB基因；