[發明專利]能穩定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

無效

• 申請號: 201410055028.5
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103805570A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 黃威權;趙鋒;朱秋融;呂葆真;李丹青
• 申請（專利權）人: 西安天星生物藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體的涉及一種能夠能穩定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株及制備單克隆抗體的用途。

背景技術

越來越多的研究表明，豬肺炎支原體是引起豬呼吸道疾病的重要病原體之一，世界范圍內大部分養殖豬都易感染豬肺炎支原體，而且任何年齡段的豬都會被侵害；據報道，美國養殖豬感染率為99%，英國養殖豬感染率為70%，法國養殖豬感染率為60%，比利時、加拿大養殖豬感染率為80%，德國、荷蘭養殖豬感染率為50%，全世界范圍平均養殖豬感染率為50%～80%。豬肺炎支原體病的典型癥狀是病豬咳嗽、呼吸困難、喘氣，故有人稱之為喘氣病；該病發病率高，死亡率低，患病豬食欲不振、發育不良、生長緩慢，飼料轉化率低。更為嚴重的是豬患了該病之后，很容易繼發感染其他細菌和病毒病，使病程延長、病情加重，甚至死亡，經濟損失加劇。

對該病的診斷迄今仍主要根據流行病學分析、臨床癥狀觀察、病理解剖觀察分析來進行初步診斷。迄今未見先進的檢測方法，如免疫檢測方法，基因檢測方法商品化的試劑盒應用于該病檢測診斷也未見相關的專利報道。

對該病的預防迄今主要采取疫苗接種，除了接種豬肺炎支原體疫苗外，還要做好其他疾病的免疫接種工作，有計劃地做好豬瘟、偽狂犬病、細小病病毒、乙型腦炎、傳染性胸膜肺炎、豬丹毒、仔豬副傷寒等免疫接種工作，確保豬群良好的免疫狀態。在治療方面，目前主要采用化學藥物抗生素治療，如用泰樂菌素、四環素、土霉素、卡那霉素、金霉素及喹諾酮類等。至今未見采用無毒、無副作用的生物藥物，如卵黃抗體及特異性轉移因子應用于對豬肺炎支原體進行防治的報道。

發明內容

為了克服我國對豬肺炎支原體病相對落后的診斷及防治方法，本發明的目的是制備豬肺炎支原體病單克隆抗體，并用其建立豬肺炎支原體病ELISA免疫檢測試劑盒。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明一方面涉及能穩定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其在制備單克隆抗體中的應用，所述的雜交瘤細胞株是保藏編號為CGMCC?NO.8011的雜交瘤細胞株或其直接傳代物。

采用本發明的方法所制備的單克隆抗體特異性強，穩定性好，所制備的試劑盒具有靈敏、準確、操作簡便，很快可以報結果，無需任何附加設備可在現場進行檢測，采樣無需抽血，不會給動物造成損害，有助于對豬肺炎支原體感染進行精準的早期診斷以及及時有效的防治。

微生物信息

豬肺炎支原體單克隆抗體雜交瘤細胞株2G2已經保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC?NO.8011，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2013年07月24日。

具體實施方式

實施例1

（一）豬肺炎支原體病單克隆抗體制備

1.免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤細胞株選用豬肺炎支原體（168株）疫苗（生產批號：119052）作免疫原。Sp20小鼠骨髓瘤細胞株從第四軍醫大學細胞工程中心購入。

2.免疫動物及免疫取雌性8周齡的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml豬肺炎支原體疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分別以豬肺炎支原體疫苗追加免疫一次，免疫注射疫苗量和第一次相同。第31天取脾細胞進行細胞融合。

3.細胞融合及培養

（1）免疫脾細胞的制備

①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液（不加小牛血清的1640培養液）的平皿中，置200目的不銹鋼網上，使脾細胞全部通過網孔擠壓到溶液中。

②將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻后，經1000rpm離心5分鐘，棄上清。

③用不完全培養液30ml倒入有沉淀脾細胞的離心管內，輕輕震動，使脾細胞重新變成懸液，再經1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用不完全培養液將沉淀細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞計數器計數，總細胞數調為1x10⁸。

（2）SP20小鼠骨髓瘤細胞懸液的制備

①將SP20小鼠骨髓瘤細胞進行擴增培養。培養液為含20%小牛血清的RPMI-1640培養液，在CO₂孵箱中培養，溫度為37℃，CO₂濃度為5%。

②將4瓶擴增培養的骨髓細胞收集到50ml離心管內。

③1000rpm離心5分鐘，棄去上清。