[發明專利]溶藻膠弧菌的LAMP快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410054928.8
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103757129A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 王淑嫻;李天保;李樂;于曉清
• 申請（專利權）人: 山東省海洋生物研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，具體涉及一種溶藻膠弧菌的LAMP快速檢測方法。

背景技術

溶藻膠弧菌廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數量居海水類弧菌之首，但其為嗜溫菌，從夏季到冬季，由赤道向兩極隨著溫度的降低其數量也明顯減少。溶藻膠弧菌也大量分布在海洋動物中，是魚、蝦、貝等海水養殖動物的條件致病菌。另外，動物機體免疫機能下降或環境惡化時也容易發生。此外溶藻膠弧菌對人的致病性也有大量報道，可引起人食物中毒、耳炎等。

目前對溶藻膠弧菌常用的檢測方法有生化鑒定、PCR、實時定量PCR等。但生化鑒定工作量大，需要至少3天的時間。PCR和實時定量PCR等現代檢測技術雖然可以滿足快速的檢測要求，但是需要專業技術人員，昂貴的試劑和檢測設備，這限制了其廣泛應用。

而利用環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?isothermal?amplication,LAMP）來檢測溶藻膠弧菌的方法能夠有效的克服上述的問題。LAMP技術是一種在等溫條件下高特異性、高效、快速擴增靶基因的DNA擴增技術。LAMP主要依賴一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，識別6-8個區域的4-6條引物，在等溫條件下（約60～65℃）快速、特意地擴增靶基因。擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的頸環結構和多環花椰菜樣結構的DNA混合物，電泳后在凝膠上形成梯子形條帶。也可以直接通過肉眼觀測反應產物中是否形成白色沉淀來判斷靶序列擴增與否。還可以通過向反應管中加入稀釋10倍的GeneFinderTM核酸染料，通過顏色變化來判斷是否存在靶序列擴增，顏色變綠，說明發生了LAMP特異性擴增，顏色仍為橙色說明沒有擴增反應。但是，目前還沒有有效的用于檢測溶藻膠弧菌的環介導等溫擴增引物。

發明內容

本發明的目的是提供一種溶藻膠弧菌的LAMP快速檢測方法，從而彌補現有技術的不足。

本發明首先提供一種用于檢測溶藻膠弧菌的LAMP引物組，引物信息如下：

VA-F3：GCGGGTATTAAACTGGCGG（SEQ?ID?NO:1）

VA-B3:TTCGTAGCTGTACTGGCTTG（SEQ?ID?NO:2）

VA-FIP：（SEQ?ID?NO:3）

TTGCTCTGGCGTTAGGCGAGTTTTCGTTACCCAAGTGCTTTGGT

VA-BIP：（SEQ?ID?NO:4）

GCCATGACGCATCAGTTGTGGTTTTACCCACTTCTTTCGCATTCA。

本發明還提供一種利用上述的LAMP引物組檢測溶藻膠弧菌的方法，包括有如下的步驟：

1）待檢測基因組DNA的提取：用細菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa公司）提取細菌DNA；

2）環介導等溫擴增步驟：根據本發明設計的溶藻膠弧菌的LAMP引物，加入反應體系中各組分，擴增溫度為63.5℃，恒溫水浴鍋中反應45min，80℃加熱2min，終止反應；

3）結果檢測：擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和加入核酸染料后通過顏色變化鑒定。

另一方面，本發明的環介導等溫擴增引物組可用于制備檢測試劑盒。

本發明引物組及方法的優點如下：1）高效靈敏：在45min的時間里，即可完成擴增，擴增模板的最低檢出限為2.08×10^-5ng/μl；2）特異性強：采用4條引物，識別6個位點，特異的擴增溶藻膠弧菌基因組DNA，而對其它細菌基因組DNA不能發生擴增反應；3）等溫：反應是在連續等溫的條件下進行,不用花費時間來改變溫度。4)費用低：只要一特定的溫度就能完成擴增反應,不需要昂貴的精密儀器和特殊試劑,總費用低。5)操作簡便：不需要進行雙鏈DNA的預變性;反應不需要開蓋,在一管內即可以完成全部檢測。6)檢測簡單：可以通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，也可直接肉眼觀察反應產物中是否產生白色沉淀或核酸染料染色后的顏色變化來定性判斷靶序列擴增與否。

附圖說明

圖1：陽性結果電泳圖，其中：M．5000bp?DNA?Marker；泳道1.陰性對照；泳道2.溶藻膠弧菌基因組DNA的LAMP產物；

圖2：LAMP方法檢測溶藻膠弧菌基因組DNA的靈敏度檢測電泳圖，