[發明專利]一種瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201410054672.0
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103789249A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王夢芝;經語佳;高健;皮宇;王洪榮;喻禮懷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/02;C12R1/63
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及一種反芻動物瘤胃微生態研究檢測用的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌的構建方法。

背景技術

眾所周知，反芻動物的消化中重要的消化過程之一是瘤胃微生物的消化（朱偉云，2004）。但由于瘤胃微生態研究的難度較大，目前還都局限于營養素在瘤胃中的消化率、瘤胃優勢菌群的培養，或用藥物控制瘤胃微生物等的研究（Koenig等，2000；韓春艷等，2002；Hristov等，2004）。對于瘤胃微生態中微生物之間的互作，如細菌與原蟲、真菌的共生；原蟲對細菌、真菌的吞噬等還都不得而知，其主要原因就是對于這一黑箱還沒有更好的研究方法。為此，同位素標記方法也曾經用于瘤胃細菌標記（劉翔等，2010），但此方法涉及特殊設備并存在一定的環境問題，而不適宜于一般實驗室的常規測定使用。我們實驗室前期探索的熒光素（Fluorescein）染料標記瘤胃細菌，但研究的也是染色后是靜態的死細菌（王夢芝等，2010），沒有所標記細菌的繁殖生長，不能夠完全反應瘤胃真實的動態狀態。因此亟待解決的關鍵問題是瘤胃微生態亮化的研究方法。

在Aequorea?victoria水母中發現的綠色熒光蛋白GFP只需藍光激發就能發光。而且GFP其相容性強，沒有種屬、組織等特異性，通過基因重組水母外的生物也產生了GFP，如：熒光的菌、鼠、兔、豬等相繼培育成功。由于GFP的特殊結構與性能，利用其做生物標記工具的研究逐漸增多（Chalfie等，1994；黃倩和李川源，2001；Southward和Surette，2002；DeBlasio等，2010）。

瘤胃細菌種類繁多，據研究表明有200余種，其中溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio?fibrivolen）具有較寬的底物代謝范圍，在瘤胃中廣泛存在，是理想的基因受體。目前已經構建成功木聚糖酶基因的溶纖維丁酸弧菌重組菌（Flint和Scott，2000）。若轉入綠色熒光蛋白基因，構建綠色熒光蛋白基因工程溶纖丁弧菌，用之即可亮化瘤胃微生態環境，實時、客觀記錄瘤胃微生態微生物的動態觀察，研究瘤胃微生態消化代謝規律和機制。

本發明即是基于瘤胃細菌GFP工程菌的改造，提供一種能夠進行瘤胃微循環檢測的瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白基因工程菌。

發明內容

為了突破目前不能真實模擬和反應瘤胃微生態的狀態，而不能進行客觀研究瘤胃微生態互作等的現狀，本發明提供一種瘤胃微生態研究用的瘤胃溶纖丁酸弧菌綠色熒光蛋白基因工程菌（RGFPB）的構建方法。

本發明所述的瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌，宿主菌為瘤胃溶纖維丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表達載體pET15b-EGFP；所述原核表達載體pET15b-EGFP是將增強型綠色熒光蛋白EGFP基因亞克隆連接入原核表達載體pET15b的BamH1位點而得到。

所述瘤胃綠色熒光蛋白GFP基因工程菌通構建方法是：采用增強型綠色熒光蛋白EGFP基因，PCR擴增其編碼序列；將所擴增序列亞克隆連接入原核表達載體pET15b，構建得到pET15b-EGFP；氯化鈣法致敏瘤胃溶維纖酸丁弧菌，轉化入所構建的原核表達載體pET15b-EGFP；轉化后平板上培養24～36h，熒光或紫外光下觀察，有綠色熒光的菌落則為陽性克隆。

本發明還公開了所述瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微循環檢測中的檢測與應用。

所述的檢測，例如瘤胃溶纖維丁酸弧菌綠色熒光蛋白GFP基因工程菌綠色熒光蛋白表達性能測試方法為：用液體和固體培養基培養瘤胃GFP基因工程菌24～36h。用722型分光光度計測定（600nm檢測）并制作液體培養基中瘤胃GFP基因工程菌生長曲線、用SpectraMaxM5多功能讀板機測定液體培養基中工程菌熒光強度（510nm檢測）；用熒光顯微鏡檢測固體培養基工程菌RGFPB表達情況。

本發明的原理是：