[發明專利]基于微流控技術的成骨細胞電刺激系統及其操作方法

有效

• 申請號: 201410054196.2
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103789206A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 陳健;祁寶昌;衛超;趙陽;衛元晨;陳德勇;王軍波
• 申請（專利權）人: 中國科學院電子學研究所
• 主分類號: C12M1/42
• 分類號: C12M1/42;C12N13/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 曹玲柱

技術領域

本發明涉及細胞體外微環境重建技術領域，尤其涉及一種基于微流控技術的成骨細胞電刺激系統及其操作方法。

背景技術

骨不愈合或延遲愈合是骨折后的嚴重并發癥，骨形成障礙是其主要原因之一。骨形成是一個復雜現象，是指間充質成骨細胞祖細胞通過募集和復制，進一步分化為前成骨細胞及成熟成骨細胞，最終導致細胞外基質的積聚和礦化的過程。在此過程中成骨細胞起了關鍵作用，因此研究如何促進成骨細胞的增殖是十分重要的。

近年來，很多學者證實多種刺激方法均可促進成骨細胞的增殖，如電、微波振動、沖擊波、磁場作用等。其中，電刺激方法的刺激來源更容易得到，而且已經有許多實驗結果證明電刺激可明顯促進成骨細胞的增殖及分化，對促進骨愈合的研究有重要作用，因此成骨細胞的電刺激研究是十分必要的。

明斯特大學的Wiesmann教授于2000年證實了電刺激能夠促進成骨細胞的生物礦化過程(biomineralization?process)。成骨細胞接受電刺激后，礦物質分泌過程明顯加強。首爾大學的In?Sook?Kim等人于2005年研究調查兩相電流刺激對鼠顱蓋骨的成骨細胞增殖、分化、合成細胞因子的影響。在此研究中，給予成骨細胞1.5μA/cm²、3000Hz的電刺激。結果表明持續電刺激后成骨細胞增殖31％，而間斷電刺激沒有明顯變化。實時監測RT-PCR和ELISA表明血管內皮生長因子(VEGF)于電刺激后明顯上調。從而得出結論兩相電流刺激可促進細胞增殖，誘導VEGF的產生。該項研究證實了電刺激的有效性。曼徹斯特大學的Griffin教授于2010年利用一種電刺激裝置，采用不同的電信號對成骨細胞產生電刺激，證實了不同電信號對成骨細胞的增殖和礦化過程具有不同程度的促進作用。

上述幾個發現和結論均通過宏觀實驗獲得，并不能準確評估電刺激對成骨細胞的影響效果，而且電刺激促進成骨細胞增殖的機制尚不完全明確，這也限制了對成骨細胞電刺激影響的進一步研究。

微流控技術又稱為“芯片實驗室”，是在微觀尺寸下控制和檢測流體的技術。由于其具有通道尺寸與人體細胞大小相匹配，網絡結構與生理狀態下細胞的空間特征相接近以及多種單元靈活組合等優點已經廣泛用于細胞生物學研究。通過微流控技術研究電成骨細胞更接近于生理狀態，更有利于揭示電刺激對成骨細胞的影響及潛在機制。基于微流控技術的成骨細胞電刺激方法為體外生長的細胞提供更加貼近體內的局部微環境，為細胞生物學提供新的研究方法。

東京大學的Kihoon?Jang等人于2007年提出一種用于藥物篩選的成骨細胞3D微流控芯片。該微流控芯片的微通道呈線形，長6cm，寬200μm，深100μm，每個通道的有效區為0.31cm²。通過此系統用很少量的細胞即獲得了預期的實驗結果。該研究說明了通過微流控技術研究成骨細胞的可行性。布朗大學的Ercan教授于2009年提出一種在微納米管內實現成骨細胞電刺激的方法。該方法中，在微納米管表面鍍一層經過陽極化處理的金屬鈦，連接信號源后給予管內的成骨細胞電刺激。該研究可以說明在該條件下電刺激對成骨細胞行為的影響。

盡管已經有不少學者通過微流控技術對成骨細胞實施刺激并觀察細胞反應，但這些實驗與方法均無法對單個成骨細胞進行分析，也無法準確評估不同電勢差對單個成骨細胞的影響效果。

發明內容

(一)要解決的技術問題

鑒于上述技術問題，本發明提供了一種基于微流控技術的成骨細胞電刺激系統及其操作方法。

(二)技術方案

本發明基于微流控技術的成骨細胞電刺激系統包括：微流控芯片，由透明材料制備，具有一用于承載細胞培養基，為成骨細胞的培養提供空間環境的微溝道，該微溝道的兩端分別設置入口和出口；倒置顯微鏡，其鏡頭從微流控芯片的底部對準微溝道的中部；兩彈性密封塞，分別塞住微溝道的入口和出口；電刺激信號源，用于提供電刺激信號，其兩電極分別穿過兩彈性密封塞后伸入微溝道內的細胞培養基液面下。

根據本發明的另一個方面，提供了一種上述成骨細胞電刺激系統的操作方法。該操作方法包括：步驟S102，對微流控芯片進行滅菌消毒；

步驟S104，將經過滅菌的微流控芯片置于培養皿內，用移液槍將細胞培養基和成骨細胞分別注入微溝道；步驟S106，封堵微流控芯片上微溝道的入口和出口，為成骨細胞培養提供培養環境，將成骨細胞培養至貼壁；以及步驟S108，在微流體溝道入口及出口分別插入電極，確保連接緊密后，連接并打開電刺激信號源，給予相應電刺激。

(三)有益效果