[發(fā)明專利]一種蚯蚓中鎮(zhèn)痛活性物質的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410054152.X
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN103751215A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 張?zhí)炝?/a>;王霞
• 申請（專利權）人: 張?zhí)炝?/a>;王霞
• 主分類號: A61K35/56
• 分類號: A61K35/56;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是蚯蚓中鎮(zhèn)痛活性物質的分離純化。

背景技術

蚯蚓，又稱為地龍，別名“地龍子”、“曲繕”，系環(huán)節(jié)動物。其味咸性寒，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿之功效。地龍作為我國傳統(tǒng)的中藥成分，廣泛應用于皮膚燒燙傷的鎮(zhèn)痛和治療，且效果顯著。呂金勝等研究了地龍醇提物的抗炎及鎮(zhèn)痛作用，發(fā)現(xiàn)地龍醇提物可明顯抑制致炎動物局部腫脹程度，降低血管通透性，大劑量顯示有明顯的鎮(zhèn)痛效果，但其作用機制不明；陳斌艷等考查了地龍粉劑對小鼠、大鼠與兔的鎮(zhèn)痛解熱作用，結果顯示地龍粉劑有明顯的鎮(zhèn)痛作用；北京中醫(yī)藥大學趙永烈等就芎芷地龍湯對偏頭痛模型動物鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用及機制進行了研究，但應用材料為中藥方劑，屬混合物。

地龍的應用歷史悠久，但目前主要的應用形式為研磨粉劑、貼劑和中藥復方等混合物，對其鎮(zhèn)痛活性成分的分離、純化及表征尚未有明確報道，這極大地限制了該活性物質在臨床上的推廣應用，以及相關鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)。本發(fā)明意在對蚯蚓中鎮(zhèn)痛活性成分進行初步的分離純化，為其鎮(zhèn)痛活性的作用機制及相關藥理學、毒理學研究打下基礎。

發(fā)明內容

據(jù)資料報道，蚯蚓中活性物質的分離純化多以蚯蚓勻漿液為原料，其成分復雜，分離步驟繁瑣，成本高且活性物質的得率較低；同時目前已有的蚯蚓鎮(zhèn)痛藥物主要為中藥研磨粉劑和貼劑，有效成分不明確且含量較低。本發(fā)明的目的在于：克服以上問題，提供一種蚯蚓中鎮(zhèn)痛活性物質的制備方法，通過高滲試劑浸提活體蚯蚓得到粗提液，采用交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱進行分離純化，得到具有高鎮(zhèn)痛活性的活性物質。該方法操作簡單、成本低廉，適合實驗室分析及規(guī)模化生產(chǎn)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是：

以活體蚯蚓為原料，經(jīng)高滲試劑浸提、低溫高速離心、混合纖維素微孔濾膜抽濾、交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾柱分離純化后獲得鎮(zhèn)痛活性成分。包括以下步驟：

（1）粗提液的制備

取活體蚯蚓以去離子水清洗3-5次，使其吐盡泥沙，瀝干待用，按每千克蚯蚓50-150g的量均勻地將高滲試劑灑在蚯蚓體表，靜置浸提30-120min，浸提液10,000-15,000g、4-10℃低溫高速離心5-20min后取上清液，以孔徑0.45μm、0.3μm或0.22μm的混合纖維素微孔濾膜抽濾，即得鎮(zhèn)痛活性物質粗提液；

（2）鎮(zhèn)痛活性物質的純化

取上述粗提液，上樣于交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱，加流動相進行分離洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，分別收集各色譜峰組分，收集液經(jīng)-40--50℃冷凍干燥，即得鎮(zhèn)痛活性物質。

在上述方法中，步驟（1）中所用的高滲試劑為葡萄糖、硫酸銨或蔗糖；步驟（1）中高滲試劑應用于活體蚯蚓，蚯蚓選自赤子愛勝蚓、雙胸蚓、異唇蚓、正蚓、鋸齒蚓中的一種；步驟（2）中使用的柱層析填料為交聯(lián)葡聚糖，包括G10、G15、G25或G50；步驟（2）中使用的流動相為去離子水、0.01M-0.05M?PBS緩沖液或0.01M-0.05M?Tris-HCl緩沖液。

附圖說明

圖為蚯蚓粗提液經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠G25分離純化所得色譜圖（實驗參數(shù)見實施例4），由圖可見，粗提液經(jīng)分離得到了四個主要色譜峰，按出現(xiàn)先后順序分別標記為p1、p2、p3及p4。G10、G15、G25、G50?對p1、p2、p3的分離效果各不相同，但有效組分p4都能得到較好的分離純化。p1、p2、p3初步鑒定為蛋白質，p4的成分初步鑒定為萜類衍生物，其紫外區(qū)內吸收范圍較寬，沒有特定的吸收波長，故280nm處的吸收峰較低。

本發(fā)明的有益效果

采用高滲試劑對活體蚯蚓進行浸提，浸提液主要為小分子物質，成分較簡單，避免了傳統(tǒng)勻漿方法中引入的蚯蚓機體構成大分子的干擾，使鎮(zhèn)痛活性成分的提取步驟簡單、得率高。已通過動物實驗初步證實了該鎮(zhèn)痛活性成分的鎮(zhèn)痛效果，簡介如下：

蚯蚓中鎮(zhèn)痛活性物質的鎮(zhèn)痛活性測定

選擇健康成年小鼠30只（體重20±2g），購自山東魯抗醫(yī)藥集團公司實驗動物中心，分為三組：空白組、實驗組及陽性對照組。經(jīng)初步檢測，圖1中四個色譜峰組分只有色譜峰p4具有明顯的鎮(zhèn)痛活性，故只對該組分進行進一步活性測定。實驗數(shù)據(jù)用mean±s?表示，組間同一時間點比較采用t?檢驗，與空白組相比，*P＜0.05?為顯著性差異，*?*P＜0.01為高度顯著性差異。?

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