[發明專利]一種多聚體熒光蛋白復合物及其應用

有效

• 申請號: 201410054047.6
• 申請日: 2014-02-18
• 公開（公告）號: CN104844711B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 高斌;王力飛;崔紅蓮
• 申請（專利權）人: 南通表源生物技術有限公司;中科微生物免疫制劑工程中心南通有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K1/26
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

1.一種制備多聚體熒光蛋白復合物的方法，

包括如下步驟：

Ⅰ、制備A片段，A片段為N端連接有2-7個甘氨酸的、可形成多聚體的熒光蛋白單體；

Ⅱ、制備B片段，B片段為C端連接有轉肽酶的識別序列的、具有識別功能的蛋白；

Ⅲ、使A片段和B片段在轉肽酶的作用下進行連接，得到所述熒光蛋白單體與所述具有識別功能的蛋白的復合物；

所述熒光蛋白單體與具有識別功能的蛋白的復合物為如下中的至少一種：由所述熒光蛋白單體組成的多聚體，該多聚體中有1個、2個、……、n個熒光蛋白單體均分別與一個所述具有識別功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于構成所述多聚體的熒光蛋白單體的數目；

所述使A片段和B片段在轉肽酶的作用下進行連接的方法為：制備含有A片段、B片段和轉肽酶的反應體系，將整個反應體系進行孵育；

所述含有A片段、B片段和轉肽酶的反應體系由所述A片段、所述B片段、所述轉肽酶、氯化鈉、氯化鈣和Tris-HCl緩沖液組成；

所述轉肽酶的識別序列為LPETG；所述轉肽酶為編碼基因序列為SEQ ID No.1所示的蛋白；

所述融合蛋白從N端至C端的序列為：具有識別功能的蛋白-LPETGGG-可形成多聚體的熒光蛋白單體；

所述A片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為轉肽酶-LPETGGG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標簽的重組表達質粒中，得到重組表達載體p-His-轉肽酶-LPETGGG；將熒光蛋白單體的編碼基因插在重組表達載體p-His-轉肽酶-LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重組表達載體p-His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體；將重組表達載體p-His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體導入大腸桿菌中，進行原核表達，純化，得到從N端至C端序列為His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；將從N端至C端序列為His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白用Tris-HCl緩沖液和氯化鈣的混合溶液室溫孵育，使得His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白斷裂為序列為His-轉肽酶-LPET的融合蛋白和序列為GGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；用His標記蛋白純化柱進行純化，收集不帶有His標簽的物質，即得到從N端至C端序列為GGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；

所述B片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為具有識別功能的蛋白-LPETG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標簽的重組表達質粒中，得到重組表達載體p-具有識別功能的蛋白- LPETG- His；將p-具有識別功能的蛋白- LPETG- His導入大腸桿菌中，進行原核表達，純化，得到從N端至C端序列為具有識別功能的蛋白-LPETG -His標簽的融合蛋白；

所述步驟Ⅲ中，整個反應體系孵育完畢后，還包括如下步驟：用His標記蛋白純化柱進行純化，收集不帶有His標簽的物質，即為所述復合物和所述熒光蛋白單體的混合物；再進行蛋白凝膠電泳純化，即得所述復合物；

所述可形成多聚體的熒光蛋白單體為DsRed；所述具有識別功能的蛋白為單區抗體；

所述單區抗體為GPA7。

2.由權利要求1所述的方法得到的多聚體熒光蛋白復合物。

3.權利要求2所述的多聚體熒光蛋白復合物在用流式細胞儀分選表面呈現靶標蛋白的細胞中的應用；所述靶標蛋白能與所述多聚體熒光蛋白復合物中的具有識別功能的蛋白相互作用。

4.權利要求2所述的多聚體熒光蛋白復合物在作為流式細胞儀分析中的兼具標記和分選功能的試劑中的應用。