[發明專利]一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法

有效

• 申請號: 201410053966.1
• 申請日: 2014-02-17
• 公開（公告）號: CN103805521B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 龔國淑;張敏;陳華保;梁銀萍;祁小波;雷雨;楊繼芝;楊春平
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明屬于植物病理學技術領域，涉及一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌（Blumeria?graminis?f.sp.tritici）的快捷方法，除該種真菌外，也可用于其它白粉菌的純化。

背景技術

1.目前主要采用的技術規程

普通純化技術為采用單孢子堆純化菌種。將從各地采集的小麥白粉病標樣在隔離條件下抖落接種在新的小麥幼苗上，接種后4～6d檢查麥葉上可見的侵染點，用剪刀剪下具有尚未產孢的單個侵染點的葉段，將其置于含有苯并咪唑保鮮基質的培養皿中，在(17±1)℃的光照培養箱中(8000lx光照，14h/d)培養，待長出分生孢子后，再次接于新的置有小麥葉段的培養皿中，4～6d后再檢查麥葉上可見的侵染點，用剪刀剪下具有尚未產孢的單個侵染點的葉段，再將其置于含有苯并咪唑保鮮基質的培養皿中。此過程需重復3次，然后擴大繁殖，獲得所謂“純化”的單孢子堆菌株。若采回的是單孢子堆，此過程可減少1次。

用上述單個孢子堆抖落接種后，立即在光學顯微鏡或體視顯微鏡下檢查，發現在同一位點上，既有單個孢子，也有2個或3個呈鏈的孢子，也有多個聚集成團的孢子堆。可見，用上述過程得到的所謂“純化”菌株，實際上并非完全遺傳同質。另外，上述純化程序耗時較長，大約需要45d。這期間需要不斷培養小麥幼苗，一般一個年度往往需要純化的菌株可能達100個以上，這樣一來涉及的工作量很大，占用的空間很多。由于純化菌株的時間拖得較長，很多材料在不斷轉純的過程中死掉了。

在此背景下，本發明采用在體視鏡下直接挑取單孢子進行純化的方法，此法大大縮短了純化過程，簡化了程序，而且能獲得完全遺傳同質的菌株。本發明的純化方法，還可適用于其它白粉菌的純化。

發明內容

本發明的目的是提供一種能獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷技術，以便為白粉病菌的相關研究提供遺傳背景一致的菌株。

基于這一目的，本發明的技術方案為：

一種獲得遺傳同質小麥白粉病菌的快捷方法，在體視顯微鏡下，用特制的挑針挑取單個分生孢子轉移到離體葉段上；葉段置于含有苯并咪唑50ppm保鮮基質的培養皿中，(17±1)℃下，光暗交替培養7d后形成一至多根孢子鏈，17d后形成直徑約0.5cm的粉霉堆。

具體流程：

（1）制作挑針取長約13厘米的竹簽，粗細如牙簽或棉簽，修為光滑的圓柱形，一端削尖后從中剖開一細縫（約1mm），將較粗直的眉毛基部插入縫隙內，留出大約2mm的尖端，用萬能膠或透明膠帶固定眉毛基部于竹簽內。

（2）保濕小麥白粉病標樣取新鮮小麥白粉病標樣，輕輕抖落老熟的分生孢子→置于保濕器內→(17±1)℃培養24h(8000lx光照，12h/d)，待長出新鮮的分生孢子備用。

（3）準備離體葉段將大約2cm長的健康葉段正面向上放置在載玻片的一端，用Marker筆在中間輕劃一個記號，也可不用作記號。

（4）挑取單個分生孢子從新鮮粉霉堆上挑取少量分生孢子抖落在載玻片的另一端上，置于體視顯微鏡載物臺上，在40～60倍下用挑針的毛尖輕輕粘取玻片上的單個孢子，然后再將帶有單個孢子的毛尖輕輕接觸葉片1-2次（解剖鏡下檢查針尖上沒有孢子后，即可確認孢子被挑到葉片上了；如果不放心，可在體視顯微鏡下把針尖上的孢子放于葉段的記號旁，此法比前者耗時）。用同樣的方法，也可直接從新鮮粉霉堆上挑取，用針尖輕輕觸碰略彎曲的孢子鏈頂端，將單個孢子粘于針尖，然后把單個孢子放于葉段上。

（5）培養轉移葉段于含苯并咪唑（50ppm）保鮮基質培養皿內→在(17±1)℃的光照培養箱中(8000lx光照，14h/d)培養，大約6～7d可見侵染點，將單個葉段轉移于另一培養皿培養，直到出現粉霉堆（其上的孢子即為遺傳同質的后代）。

（6）擴繁將帶此粉霉堆的葉段放置在無菌的載玻片上，再次置于體視顯微鏡下→用挑針從此粉霉堆上挑取任意多的分生孢子→在體視顯微鏡下將分生孢子抖落在健康葉段上，可在一個葉段上多次重復接種，以后一個葉段上可繁殖很多粉霉堆。用此方法只要獲得一個純的粉霉堆，就可繁殖大量的分生孢子。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，本發明用以下具體實例進行說明，本發明主要針對小麥白粉病菌進行快速純化，但本發明不局限于這些具體實施例。具體實施方法如下：

1、健康麥苗的培育