[發明專利]一種蝴蝶蘭體細胞胚發生同步化調控方法

有效

• 申請號: 201410053265.8
• 申請日: 2014-02-07
• 公開（公告）號: CN103782911A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 劉福平
• 申請（專利權）人: 福建省亞熱帶植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于農林領域的園藝植物種苗繁殖生物技術，具體涉及一種蝴蝶蘭體細胞胚發育同步化的調控方法。

背景技術

植物體細胞胚胎發生是研究植物細胞全能性和胚胎發生機制的重要系統，同步化的體細胞胚發生體系，是研究其生理、生物化學和分子生物學等問題所必需的。在生產實踐中，要利用體細胞胚胎發生這種有效的離體繁殖方式，真正實現工廠化和標準化生產，也需實現體細胞胚發生的同步化，在人工種子研制方面，獲得形態上、成熟度相似的同步體細胞胚，是人工種子自動化生產，機械化播種，發芽整齊的重要前提。此外，體細胞胚是許多植物優良的遺傳轉化受體系統，是優良品系獲得和大量擴繁的較好方式。目前已從多種植物中成功誘導出體細胞胚并獲得大量再生植株，但體細胞胚發生的不同步化仍是需要解決難題之一。蝴蝶蘭組培類原球莖是體細胞胚的表現形式已經得到普遍認同，類原球莖在生產實踐中具有相當大的應用潛力，采用類原球莖繼代擴繁，繁殖系數比目前廣泛采用叢生芽擴繁方式高得多，適合新品種迅速占領市場和工廠化大規模生產。類原球莖是蝴蝶蘭人工種子制作的理想材料，類原球莖本身富含營養物質，免去人工胚乳，簡化制作工藝，類原球莖表皮厚有蠟質層，較好抵御病菌感染，有望提高成活率。常規蝴蝶蘭類原球莖發育同步化約60％，無法滿足其在基礎理論研究和生產實踐的要求。

為了能夠獲得大量發育階段一致的體胚，研究人員們采用了一系列的方法對同一發育階段的體細胞胚進行機械分離和體胚發生的同步化控制。在取得的少量成果中，實用性成果較少，國內專利“一種霍山石斛體細胞胚發生的方法”(公開號：CN102246697A)，采用過篩法或饑餓法(用無鐵鹽的MS培養基)同步化增殖培養，得同步化的霍山石斛體細胞胚。“一種同步化調控針葉樹體細胞胚發生方法及其培養基”(公開公告號：CN101633903)，將繼代后的胚性細胞系接種于優化增殖培養基中，控制搖床轉速為110±30轉／分鐘，在23±5℃溫度、暗培養條件下，增殖獲得同步化的胚性細胞系。“一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法”(公開號CN101503671A)，將球形體細胞胚接種于同步化調控培養基(1／2MS為基本培養基，包含20000～50000mg的蔗糖和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8)中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％、每20～30天更換新鮮培養基，無光照條件下培養40～60天，成熟體細胞胚發育的一致性達80％以上。專利“雜交鵝掌楸體胚發生同步化控制方法”(公開號：CN102037896A)，用過篩法將各級胚狀體分級培養，半固體成熟培養基配方為：MS培養基，2～10mg·L-1ABA，2g·L-1AC，100mg·L-1CH，40g·L-1蔗糖，5g·L-1瓊脂；或液體培養基(MS培養基，2～10mg·L-1ABA，100mg·L-1CH，40g·L-1蔗糖)培養，得到同步的成熟胚，在球形胚發育同步率達90％左右，心形及魚雷形胚階段同步化率為40％左右。關于蝴蝶蘭體胚發生同步化控制方法尚未見報道和專利。

上述體細胞同步發生調控方法，機械過篩法操作繁瑣、污染率高，適用于液體懸浮培養體細胞胚，細胞營養饑餓對細胞傷害較大，從資料上來看優化增殖培養基或改進培養條件不是體胚發生同步化控制的主要方法。

發明內容

目前已知植物體細胞同步發生調控方法有物理、化學的多種方法，但都無一例外的同時或交叉使用兩種或兩種以上方法進行同步發生調控才能取得較滿意的效果。本發明的調控原理是根據(1)蝴蝶蘭外植體在較高濃度細胞分裂素才能誘導出幼嫩類原球莖(團)，隨后可在較低濃度或無細胞分裂素的培養基繼續發育至成熟。(2)蝴蝶蘭外植體誘導前期需要較高的氧化脅迫水平，外植體分化出胚性母細胞(培養第11-18天)后的進一步發育需要較低的氧化脅迫水平。(3)植物誘導胚性母細胞到其發育成球形胚、梨形胚到最后成熟胚整個過程，所需培養環境的滲透壓相應逐漸降低。所以本發明在蝴蝶蘭體細胞胚誘導、生長、成熟過程的不同階段，在培養基添加抗氧化劑，高滲物質(甘露醇等)來調控體細胞胚同步發生節奏，達到同步調控蝴蝶蘭體胚發生發育的目的。

本發明提供的技術方案如下：

一種蝴蝶蘭體細胞胚發育同步化的調控方法，

步驟1：以蝴蝶蘭組培類原球莖切塊為外植體，初始培養基添加細胞分裂素、高濃度高滲物質。

步驟2：培養約第18天(出現胚性母細胞)，轉入含細胞分裂素、維持較高濃度高滲物質、添加抗氧化劑的培養基。