[發明專利]干腐病馬鈴薯塊莖中單端孢霉烯族毒素的提取純化和檢測分析方法

無效

• 申請號: 201410051214.1
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103808838A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 薛華麗;畢陽;蒲陸梅;毛學榮;唐亞梅
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: G01N30/14
• 分類號: G01N30/14;G01N30/02
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張克勤

技術領域

????本發明屬于檢測分析領域，具體涉及一種干腐病馬鈴薯塊莖中單端孢霉烯族毒素的提取純化和檢測分析方法。

背景技術

馬鈴薯是我國的主要經濟作物，年產量近8000萬噸。甘肅省作為我國馬鈴薯主產區，占全國總產量近25%。然而馬鈴薯塊莖在貯藏期間極易受到鐮刀菌(Fusariumspp.)的侵染而發生干腐病，西北主產區的發病率為15-25%。本申請人研究發現，Fusarium?sulphureum是引起甘肅省馬鈴薯塊莖干腐病的最主要病原菌，它不僅給馬鈴薯產業帶來巨大的經濟損失，而且由于塊莖體內會積累大量的真菌毒素，主要以單端孢霉烯族毒素A型（T-2、DAS）和B型(Fus-X、3ADON)為主，該類毒素具有對人畜的潛在致癌危害。

單端孢霉烯族毒素在干腐病馬鈴薯塊莖中的存在，不僅降低了塊莖的食用安全性，而且會隨帶病塊莖的加工進入馬鈴薯全粉和淀粉制品中，由于其在高溫條件下非常穩定，加工過程中很難失活,因此帶來了很大的安全隱患。因此，檢測A（T-2、DAS）和B型(Fus-X、3ADON)單端孢霉烯族毒素在干腐病馬鈴薯塊莖中的存在情況，對保證馬鈴薯塊莖食用安全是非常必要的。

目前單端孢霉烯族類毒素常采用的檢測方法基本上分為免疫化學分析法和物理化學檢測法兩大類。免疫化學分析法主要包括酶聯免疫吸附法、免疫親和層析法和放射免疫法等，該法具有特異性高、敏感性強、快速方便、不需要昂貴儀器設備等優點，但檢測結果易出現假陽性，且要制備用于ELISA的高效、特異的單抗或多抗，需要一個復雜的過程；物理化學檢測主要包括薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法。薄層色譜法是我國及其他許多國家的標準方法，但其操作比較繁瑣、有機溶劑用量較大、準確度低等缺點。氣相色譜法雖然可以對A型和B型單端孢霉烯族類毒素進行同時檢測，需要進行衍生，操作繁雜。液相色譜法是真菌毒素類物質檢測最常用的方法。

發明內容

本發明目的是提供一種A型和B型單端孢霉烯族類毒素同時提取、純化和檢測的方法，主要針對A型T-2，DAS和B型Fus-X,?3ADON的檢測，以解決現有氣相色譜和高效液相色譜檢測中存在雜峰較多，受基質干擾嚴重的問題。

本發明是這樣來實現的：一種干腐病馬鈴薯塊莖中單端孢霉烯族毒素的提取純化方法，包括以下步驟：

A、樣品預處理：選取外觀整齊，無病蟲危害的馬鈴薯塊莖，消毒，然后用無菌水沖洗，過夜晾干；然后在馬鈴薯塊莖上打2-3個接種孔，去除其中的塊莖組織，立即向接種孔中接種硫色鐮刀菌（Fusarium?sulphureum）的菌餅，被接種的馬鈴薯置于無菌塑料袋中5℃溫度下孵育60d，接著切取馬鈴薯塊莖的病部組織，置于零下80℃的冰箱中冷藏待用；

B、?樣品的提取：取出冷藏的霉心病病部組織，粉碎后稱取5.0g于50mL的離心管中，加入25mL乙腈水溶液（乙腈與水的體積比為84:16），漩渦均質3min，4℃溫度下離心5min，離心機最大相對離心力為11000×g，上清液過濾轉入150mL容量瓶中，下層沉淀用如上的方法重復提取兩次，合并前3次的上清液于圓底燒瓶中，在60℃溫度下旋轉蒸發至近干，再用氮氣流吹干，接著用4mL乙腈水溶液（乙腈與水的體積比為84:16）溶解，經規格為4mL的priboFast?M270的凈化柱進一步純化，將待純化液體轉入凈化柱中，然后在30s之內迅速推下活塞，讓溶液通過凈化柱，得洗脫液；再將洗脫液減壓旋轉蒸發至近干，殘留物通過氮氣流吹干后復溶于1mL的流動相中，最后通過0.22微米的微孔濾膜，上機待測。

優選地，步驟A樣品預處理中馬鈴薯塊莖用0.5%的次氯酸鈉表面消毒。

優選地，步驟A樣品預處理中馬鈴薯塊莖的接種孔位置在果實的徑向中部，接種孔的深度1cm，直徑0.8cm。

優選地，步驟A樣品預處理中硫色鐮刀菌（Fusarium?sulphureum）的培養基為PDA培養基（現有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基），培養7天，菌餅的細菌菌落總數達到1×10⁵?CFU/mL。

優選地，步驟A樣品預處理中接種量為20微毫升。